химический каталог




ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

Автор Химическая энциклопедия г.р. Н.С.Зефиров

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА, основаны на использовании химический реакций с участием ферментов. О содержании определяемого компонента судят либо по кол-ву конечного продукта ферментативной реакции, либо, чаще, по начальной скорости процесса, положенного в основу методики определения (см. Кинетические методы анализа). Для наблюдения за скоростью ферментативной реакции применяют обычно инструментальные методы, чаще других - люминесцентные, спектрофотометрич., электрохимические. Достоинства ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА м. а.: высокая чувствительность, обусловленная активностью ферментов, природой индикаторных реакций (с помощью которых определяют вещество) и способами детекции аналит. сигна ла; высокая селективность и мягкие условия проведения анализа.

Определяемым компонентом в ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА м. а. могут быть субстраты (в-ва, превращение которых катализирует фермент), сами ферменты, коферменты (в-ва, необходимые для осуществления каталитических действия фермента) и эффекторы (соединение, изменяющие каталитических активность фермента - активаторы, ингибиторы). Среди коферментов - НАД и НАДН (соответственно никотинамидадениндинуклеотид и его восстановленная форма), НАДФ и НАДФН (соответственно никотинамидаденинди-нуклеотидфосфат и его восстановленная форма), АТФ (аде-нозинтрифосфат) и др.

Предел обнаружения, нижняя и верхняя границы определяемых содержаний компонентов зависят от кинетическая характеристик используемой индикаторной ферментативной реакции и, прежде всего, каталитических активности фермента.

Фермент катализирует реакции, в которых участвуют, как правило, один или два субстрата. В односубстратной реакции концентрация субстрата [S]0 пропорциональна скорости процесса v0 только при условии [S]0Км, где Км -константа Михаэлиса. Следовательно, верхняя граница определяемых содержаний лимитируется, как правило, величиной Км. Предел обнаружения и ниж. граница анализируемых содержаний субстрата определяются обычно той величиной v0, которая может быть зафиксирована выбранным инструментальным методом. Чем меньше величина v0 и чем выше каталитических константа скорости kкат и концентрация [E]0 фермента, тем ниже предел обнаружения и нижняя граница определяемых содержаний субстрата. Для двусубстратных реакций при определении субстрата S1 субстрат S2 берется в насыщенных концентрациях и двусубстратная реакция сводится к одно-субстратной.

В случае обратимого неконкурентного инги-бирования фермента ингибиторы I, взаимодействуя с ферментом, образуют каталитически неактивные комплексы EI. Для ингибиторов этого типа верхняя граница определяемых содержаний лимитируется величиной KI =[EI] ; предел [E][I] обнаружения и нижняя граница определяемых содержаний зависят также и от концентрации фермента. Такие же зависимости сохраняются и при определении обратимых активаторов ферментов.

В случае необратимого ингибирования ферментативных реакций ниж. граница определяемых содержаний ингибитора зависит от времени ингибирования. Если значение константы скорости этого процесса kин невелико, относит. уменьшение активности фермента зависит от длительности процесса ингибирования. При достаточно больших kин временной зависимостью можно пренебречь, тогда относит. уменьшение активности фермента пропорционально концентрации ингибитора: = n[I], где n - число молекул ингибитора, взаимодействующего с одной молекулой фермента.

В ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗАм. а. часто используют системы, состоящие из нескольких сопряженных реакций, катализируемых различные ферментами. Так, например, в случае системы из двух реакций продукты первой ферментативной реакции являются субстратами для второй ферментативной реакции (индикаторной), что позволяет повысить чувствительность определения того или иного соединения и при необходимости изменить способ детекции. Так, например, для определения глюкозы применяют реакцию ее окисления кислородом воздуха до глюконовой кислоты и H2O2, катализируемую глюкозооксидазой. Для контроля за скоростью процесса используют электрохимический методы, наблюдая за уменьшением количества кислорода в растворе с помощью О2-чувствительного электрода Кларка или измеряя рН раствора. Миним. содержание глюкозы, которое можно определять этими способами детекции, 0,01-0,03 мМ. Применяя биферментативные сопряженные реакции для определения глюкозы, контролируют количество образовавшегося H2O2, например по реакции окисления пероксидом водорода в присутствии пероксидазы о-дианизидина (3,3"-диметок-сибензидина) с образованием окрашенного вещества или люмино-ла с образованием люминесцирующего соединения. Спектро фотометрич. или люминесцентный методы контроля позволяют определять содержание глюкозы соответственно 2 мкМ и 20 нМ.

Как правило, чувствительность определения ферментов, коферментов и эффекторов выше, чем чувствительность определения субстратов. Например, возможно определение 0,001 пМ содержания АТФ, 0,1 нМ ионов Hg2+, Cu2+, Zn2+, 0,1 мкМ тиомочевины и меркаптоэтанола. Однако ряд субстратов определяют также при очень малых содержаниях, особенно при хеми- или биолюминесцентной (см. ниже) регистрации аналит. сигнала: 0,1 нМ H2O2, 0,01 нМ мочевины. Чувствительность определения многие веществ ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА м. а. часто более высока, чем чувствительность определения этих же компонентов любыми др. методами.

Высокая селективность ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА м. а. обусловлена образованием фермент-субстратного комплекса в процессе каталитических акта, требующим структурного соответствия активного центра фермента и субстрата. Поэтому большинство ферментов активно только в реакциях с субстратом одного определенного типа или с группой субстратов, имеющих общие структурные группы. Например, фермент глюкозооксидаза катализирует окисление практически только одного вида глюкозы - -глюкозу, к-рую можно определять без разделения сложной смеси моно-и олигосахаридов. В данном случае проявляется субстратная специфичность фермента.

Групповую специфичность можно наблюдать в случае действия альдегидоксидазы в реакциях превращения алифатич. альдегидов. Значительно менее селективны методы определения эффекторов, т. к. обычно имеется группа различные соединение, в той или иной степени меняющих каталитических активность данного фермента. Однако селективность определения эффекторов м. б. и очень высокой. Так, очень малые количества ртути (10 пМ) можно определять по ее ингибирующему действию на пероксидазу хрена на фоне тысячекратных кол-в Bi и Cd и значительно больших кол-в многие неорганическое и органическое веществ.

Использование иммобилизованных ферментов. Недостатки ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА м. а. обусловлены рядом особенностей ферментов: потерей функциональной активности и стабильности ферментов под воздействием различные факторов; высокой стоимостью из-за невозможности многократного использования растворимых ферментов и трудности их выделения и очистки. Применение иммобилизованных ферментов расширило возможности ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА м. а. Более высокая стабильность и возможность многократного использования иммобилизованных ферментов позволили снизить стоимость анализов, повысить экспресс-ность, проводить химический анализ в потоке и автоматизировать ферментативные методы. Впервые иммобилизованные ферменты в химический анализе применили в сер. 60-х гг. 20 в. Для обнаружения фосфорорганическое пестицидов в воздухе использовали холинэстеразу, включенную в крахмальный гель, нанесенный на полиуретановую пластинку. С помощью глюкозооксидазы или лактатдегидрогеназы, включенных в полиакриламидный гель, определяли соответственно глюкозу или молочную кислоту.

Помимо единичных иммобилизованных ферментов, в химический анализе используют соиммобилизованные ферментные системы, позволяющие повышать чувствительность и селективность определения. При этом все чаще применяют иммобилизованные клетки микроорганизмов, содержащие естественный набор ферментов. Преимущество такой иммобилизации состоит в том, что исключаются стадии выделения, очистки и иммобилизации ферментов, увеличивается их стабильность. Иммобилизацию используют не только для ферментов, но и для субстратов, коферментов и эффекторов.

Предложены разнообразные реакторы с иммобилизованными ферментами- колонки, трубки, полые нити. Для заполнения колонок применяют обычно ферменты, ковалентно связанные с аминированным стеклом, акриловыми полимерами, агарозой, сефарозой, найлоновым порошком, силикагелем и т. д. Один из лучших носителей для колоночных реакторов - ссфароза, активированная бромци-аном. На ней успешно иммобилизовали и полиферментные системы. Так, для определения 2-20 мкМ триптофана анализируемую смесь пропускали через колонку, содержащую со иммобилизованные на бромциан-сефаразе триптофаназу и лактатдегидрогеназу.

В трубчатых реакторах фермент ковалентно иммобилизуется на внутр. поверхности найлоновой трубки, длина которой варьирует от 1 до 3 м. С помощью таких реакторов, прокачивая через них анализируемый раствор, определяют, например, в сыворотке крови мочевину, мочевую кислоту, аминокислоты, глюкозу, лактозу, мальтозу, пенициллин.

Разработан метод включения ферментов внутрь полых волокон триацетатцеллюлозы в момент их формования. Фермент оказывается включенным во внутр. полость, куда могут проникать только низкомолекулярный субстраты. Эти нити накручивают в виде катушек, заключают в стеклянную оболочку и через такой бобинный ферментный реактор пропускают анализируемую смесь, например, при определении пенициллина, мочевины или глюкозы.

Скорость пропускания потока смеси растворов, содержащих анализируемую пробу и реагенты, через реакторы устанавливают такой, что после прохождения через ферментный реактор реакция либо заканчивается (при анализе по конечному продукту), либо протекает до определенной глубины (скорость обычно определяют способом фиксированного времени).

Разновидности ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА м. а. Среди наиболее чувствительных ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА м. а. особое место занимают би о люминесцентные методы (см. Люминесцентный анализ}. Чаще других используют процессы, катализируемые ферментом люциферазой светляков. Система включает люциферин (формула 1, люциферин светляка), который в присутствии АТФ подвергается катализируемому люциферазой окислению кислородом с образованием люминесцирующего вещества. Высокий квантовый выход биолюминесценции, применение полиферментных сопряженных реакций позволяет определять некоторые соединения при концентрации 0,001-0,1 пМ.


Один из важных ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗАм. а.- анализ с использованием ферментных электродов, которые сочетают высокую селективность биокатализа и совершенную технику электрохимический методов. В простейшем варианте расгворимый фермент помещают между двумя полупроницаемыми мембранами; одна отделяет раствор фермента от электродного датчика, другая - от анализируемого раствора. Однако чаще ферменты иммобилизуют, включая их в полимерные или гелевые пленки альбумина, желатины, агар-агара, коллагена, гидроксида Al или ковалентно присоединяя к поверхности стеклянных дисков, полупроницаемых мембран (целлюлозных, поликарбонатных). Пленки прикрепляют к поверхности электрода. Часто такую пленку (мембрану) готовят непосредственно на поверхности электрода. Субстрат диффундирует через слой, содержащий фермент, образуя электроактивное вещество, детектируемое при помощи потен-циометрич. или амперометрич. датчика.

Преимущества потенциометрич. детектирования - легкость изготовления ферментного электрода и более низкая его стоимость. Однако время отклика таких электродов весьма значительно. В качестве электрохимический датчиков при создании ферментных электродов этого типа часто используют стеклянный рН-электрод, NH+4-специфичный электрод, газовые электроды для CO2 и NH3. Потенциометрич. ферментные электроды были предложены для определения аминокислот, мочевины, глюкозы, пенициллина, нитрит- и нитрат-ионов; применяемые ферменты - оксидазы и декарбоксилазы аминокислот, уреаза, глюкозооксидаза, нитрит- и нитратредукта-зы и др.

Амперометрич. ферментные электроды обычно применяют в случае ферментативных реакций, протекающих с выделением или потреблением O2 или H2O2. Используют при этом O2- или H2O2-чувствительные электроды. Амперометрич. детекторы отличаются от потенциометрических более широким диапа зоном линейности. В амперометрич. ферментных датчиках применяют чаще всего ФАД(флавинадениндинуклеотид)-за-висимые оксидазы для определения глюкозы, холестерина, аминокислот.

В ферментных электродах может быть использованы не только одноферментные и полиферментные системы, но и клетки микроорганизмов ("бактериальные" электроды). Созданы ферментные электроды с ферментным реактором. В таком электроде иммобилизованный (например, на стеклянных шариках) фермент помещен в небольшой реактор, через который пропускают анализируемую пробу. Продукты реакции - электроактивные вещества, их детектируют с помощью проточных измерительных электродов. Ферментные электроды такого типа применяют для определения мочевины и аминокислот.

Ферментные электроды представляют собой биосенсоры (см. Сенсоры химические), которые позволяют быстро и селективно проводить определение целого ряда компонентов в сложных по составу объектах.

На основе использования ферментов созданы различные экспресс-тесты. Многие из них чрезвычайно просты. Например, тест-устройство для определения токсичных фосфорсодержащих пестицидов в продуктах питания представляет собой бумажную полоску, один конец которой пропитан раствором хро-могенного субстрата, а второй содержит иммобилизованную холинэстеразу. При анализе концы полоски совмещают и обмакивают в воду, выжатый из фруктов или овощей сок и т. д. Появление окраски бумажки свидетельствует об отсутствии пестицидов в пробе. T. к. пестициды в больших, чем ПДК, количествах ингибируют холинэстеразу, то отсутствие окраски свидетельствует о превышении ПДК пестицидов. Аналогичные бумажные тесты предложены для определения глюкозы в моче и крови, ртути в воде и т. д.

Широкое распространение получают иммунофер-ментные методы- разновидность иммунных методов анализа (радиоактивная или флуоресцентная метка заменяется ферментом). Их используют для определения иммуногло-булинов, гормонов, стероидов, лек. средств, пестицидов и др. Эти методы обладают исключительно высокой чувствительностью и селективностью.

Для повышения воспроизводимости, экспрессности и производительности в ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА м. а. применяют автоматич. анализаторы разного типа (см. Автоматизированный анализ). Катали-тич. реакции с участием растворимых и иммобилизованных ферментов, а также ферментных реакторов все чаще используют в проточно-инжекционном анализе.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА м. а. применяют в химический анализе, по сравнению с другими методами, недостаточно. Из более чем 1800 полученных ферментов используют около 50; наиболее часто - глюкозооксида-зу, уреазу, уриказу, люциферазу, пероксидазу, алкогольдегид-рогеназу, холинэстеразу, лактатдегидрогеназу, различные аминоок-сидазы. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА м. а. позволяют определять селективно, а в отдельных случаях специфично такие биологически активные субстраты, как глюкоза, мочевина и мочевая кислота, различные аминокислоты, липиды, холестерин, антибиотики, этанол, H2O2, NO-2 и NO-3 и многие другие. Разработаны чрезвычайно чувствительные методы определения многие ферментов (перок-сидазы в крови, креатинфосфокиназы в крови при диагностике инсульта и инфаркта миокарда и др.) и коферментов (НАД, флавинмононуклеотид, АТФ и т.д.). Предложены методики чувствительного определения большого числа эффекторов ферментов (фосфорсодержащие пестициды, ионы Hg, Cu, Zn и др.). Чрезвычайно чувствительны и селективны методы определения некоторых ионов металлов (Zn, Cu) и анионов (CN-) на основе реактивации апоферментов. Цинк, например, определяют практически специфически и в пикограммовых количествах по реактивации иммобилизованной пируватоксидазы, дезактивированной рядом комплексонов.

Осн. области применения ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА м. а.- клинич. медицина и биохимия. С помощью ферментов в крови, моче, тканях и др. биологическое объектах определяют малые количества физиологически активных веществ, метаболитов, ферментов, мутагенов, канцерогенов, лек. препаратов. Высокочувствительный и специфический биолюминесцентный метод определения АТФ позволяет разрабатывать методики измерения количества клеток микроорганизмов, обнаружения микробных заражений, определения антибиотиков в биологическое тканях и жидкостях по степени инги-бирования микробных клетоколо Поскольку содержание АТФ пропорционально кол-ву клеток или биомассы, то эти методики чрезвычайно чувствительны и предел обнаружения может достигать 100 клетоколо Ферментативные методы используют также в пищевая и фармакологич. промышлености, при контроле загрязнений окружающей среды. Так, например, разработаны и применяются ферментативные методы определения фосфорсодержащих пестицидов, фенолов, аминов, ионов тяжелых металлов в природных и сточных водах.

Литература: Долманова И. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА, Угарова Н.Н., "Ж. аналит. химии", 1980, т. 35, в. 8, с. 1597-1639; Кулис Ю.Ю., Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов, Вильнюс, 1981; Угарова H. H., Б r о в -ко Л. Ю., Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ, M., 1981; Bioana-lytical applications of enzymes, ed. by C. Suelter, в сб.: Methods of biochemical analyses, N. Y., 1992. И. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА Долманова.


Химическая энциклопедия. Том 5 >> К списку статей


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]    [обратная связь]

 

 

Реклама
обучение вентиляция и кондиционирование москва
ножи solingen купить
на каком расстоянии можно ставитьь баннер
александр малинин влюбленный в романс 2017

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(30.05.2017)