химический каталог




НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Автор Химическая энциклопедия г.р. И.Л.Кнунянц

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ (полинуклеотиды), биополимеры, осуществляющие хранение и передачу генетич. инфор-мации во всех живых организмах, а также участвующие в биосинтезе белков.

Первичная структура НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. представляет собой последовательность остатков нуклеотидов. Последние в молекуле НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. образуют неразветвленные цепи. В зависимости от природы углеводного остатка в нуклеотиде (D-дезоксирибозы или D-рибозы) НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. подразделяют соответственно на дезоксирйбонуклеи-новые (ДНК) и рибонуклеиновые (РНК) кислоты. В молекуле ДНК гетероциклы, входящие в остаток нуклеотида, пред ставлены двумя пуриновыми основаниями - адeнином (А) и гуанином (G), и двумя пиримидиновыми основаниями -тими-ком (Т) и цитозином (С); РНК вместо Т содержит урацил (U). Кроме того, в НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. в небольших количествах обнаруживаются модифицированные (в основные метилированные) остатки нуклеозидов- так называемой минорные нуклеозиды, к-рыми особенно богаты транспортные рибонуклеиновые кислоты (тРНК). Отдельные нуклеотидные остатки связаны между собой в полинуклеотидных цепях 3»-5»-фосфодиэфирными связями (см. формулу). Стандартная запись нуклеотидной последовательности осуществляется в направлении от 5»-конца к 3»-концу (каждый нуклеотид обозначают буквой, присвоенной основанию, которое он содержит; например, последовательность приведенного участка ДНК записывается как ACGT).



Св-ва ДНК и РНК различны. Так, РНК легко расщепляется щелочами до мононуклеотидов (благодаря наличию группы 2»-ОН), в то время как полинуклеотидные цепи ДНК в тех же условиях стабильны. Это структурное различие определяет и меньшую устойчивость к воздействию кислот N-гликозидных связей (связь между гетероциклом и остатком рибозы) в ДНК по сравнению с РНК.

Дсзоксирибонуклепновые кислоты. Нуклеотидный состав ДНК подчиняется ряду правил (т.называют п р а в и л а Ч а р г а ф-ф а), важнейшее среди которых-одинаковое содержание А и Т, G и С у любой клеточной ДНК. Нуклеотидный состав РНК подобным правилам не подчиняется.

Пространствю структура ДНК описывается как комплекс двух полинуклеотидных антипараллельных цепей (рис. 1), закрученных относительно общей оси, так что углевод-фосфатные цепи составляют периферию молекулы, а азотсодержащие гетероциклы направлены внутрь (д в о й н а я с п и р а л ь У о т с о н а-К р и к а). Антипараллельность полинуклеотидных цепей выражается в том, что на одном и том же конце спирали одна полинуклеотидиая цепь содержит (незамещенную или замещенную) группу 5»-ОН, а другая 3»-ОН. Фундам. свойство двойной спирали ДНК состоит в том, что ее цепи комплементарны друг другу (см. Комплемен-тарностъ)вследствие того, что напротив А одной цепи всегда находится Т другой цепи, а напротив G всегда находится С. Комплементарное спаривание А с Т и G с С осуществляется посредством водородных связей. Классич. двойная спираль Уотсона-Крика получила назв. В-формы ДНК. Она-правозакрученная, плоскости гетероциклический оснований перпендикулярны оси спирали, а число пар остатков нуклеотидов на один виток спирали равно примерно 10; расстояние между витками 3,4 нм. При изменении ионной силы и состава растворителя двойная спираль изменяет свою форму и даже может превращаются в левозакрученную спираль (т.называют Z-форму), которая содержит в одном витке около 12 остатков нуклеотидов. При дегидратации В-формы образуется А-форма ДНК-правозакрученная двойная спираль, содержащая в одном витке около 11 остатков нуклеотидов, плоскости гетероциклический оснований повернуты примерно на 20° относительно перпендикуляра к оси спирали. Двойная спираль ДНК способна денатурировать (например, при повышении температуры) с полным расхождением комплементарных цепей, которые сохраняют способность к ассоциации с восста новлением (рекатурацией) двойной спирали при возвращении к исходным условиям. Подробно изучены также кон-формации фрагментов ДНК.

Рис. 1. Двойная спираль ДНК (стрелками показано направление полинуклеотидной цепи). .



Установлено, чго молекула ДНК в клетке представляет собой совокупность генов, регуляторных участков (последовательностей, связывающихся с регуляторными белками и управляющих уровнем экспрессии генов), районов, участвующих в организации генов в хромосомах, а также последовательностей, функции которых еще не известны.

У прокариот (бактерии и синезеленые водоросли) ДНК организована в виде компактного образования-н у к л е о и-д а, который содержит всю хромосомную ДНК клетки длиной в несколько миллионов пар нуклеотидов (м.п.н.). Кроме того, у многие прокариог и эукариот (все организмы, за исключением прокариот) обнаружены ьнехромосомные ДНК (так называемой плаз-миды)размером от несколько тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) до несколько десятков т.п.н. (м.п.н. и т.п.н.-принятые единицы длины двухцепочечной молекулы НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк.)-

Мн. ДНК образуют кольцевые структуры. В том случае, если обе полинуклеотидные цепи ДНК ковалентно непрерывны, ДНК может находиться в сверхспирализованной (сверхскрученной) форме (рис. 2). В клетках сверхспирализа ция осуществляется ферментами ДНК-гиразами (топоизомера зами II).

Хромосомные ДНК эукариот локализованы в клеточном ядре, где вместе с гистонами и негистоновыми белками образуют хроматин -ну-клеопротеид, из которого организованы хромосомы. Размеры ДНК в отдельных эукариотич. хромосомах колеблются в широких пределах-от 103 до 105 т.п.н.

Рис. 2. Сверхспирализация двухцепочечной кольцевой ДНК под действием ДНК-гиразы: 1 - кольцевая форма ДНК; 2 - сверхспирализованная форма ДНК.


Геномы многие вирусов бактерий (бактериофагов), животных и в более редких случаях растений представлены ДНК. Такие клеточные органеллы, как митохондрии и хлоропласты, имеют также свою собственную ДНК размером от несколько десятков до несколько сотен т.п.н.

Биосинтез ДНК осуществляется в результате репликации-точного самокопирования (самовоспроизведения) путем синтеза новой молекулы ДНК на исходной ("материнской"), которая играет роль матрицы. Этот процесс осуществляется под действием фермента ДНК-полимеразы. Матрицей для синтеза ДНК может служить также однотяжевая (одноцепочечная) РНК, комплементарное копирование которой осуществляет фермент обратная транскриптаза.

Рибонуклеиновые кислоты. РНК, как правило, построены из одной полинуклеотидной цепи, характерный элемент вторичной структуры которой - "шпильки", перемежающиеся однотяже выми участками (рис. 3). Шпилька - двутяжевая спиральная структура, образующаяся в результате комплементарного спарива ния оснований (А с U и G с С). Шпильки и соединяющие их одно-тяжевые участки РНК укладываются в компактную третичную структуру. Для тРНК вторичная структура имеет характерную форму, к-рую называют "клеверным листом". Известны редкие примеры целиком двухспиральных молекул РНК.

Двухспиральные гибридные комплексы (ДНК и РНК) может быть искусственно получены из комплементарных однотя-жевых ДНК и РНК. Функциональноактивные РНК имеют размер от 70-150 до несколько тысяч нуклеотидных остатков. Биосинтез РНК (транскрипция)обычно происходит в результате комплементарного копирования ДНК-матрицы, которое осуществляет фермент РНК-полимераза.

Известно несколько типов РНК. Рибосомные рибонуклеиновые кислоты, связываясь с рибосомными белками, образуют рибосомы, в которых осуществляется синтез белка. Матричные рибонуклеиновые кислоты служат матрицами для синтеза белков (трансляции). тРНК осуществляют связывание соответствующей аминокислоты и ее перенос к рибосомам. Обнаружены т.называют малые ядерные РНК, участвующие в превращаются первичных продуктов транскрипции в функционирующие молекулы; т.называют антисмысловые РНК участвуют в регуляции биосинтеза белка и репликации плазмидных ДНК. В виде РНК представлены геномы многие вирусов (РНК-содержащие вирусы), в которых матрицами для синтеза РНК служат вирусные РНК. Некоторые РНК обладают ферментативной активностью, катализируя расщепление и образование фосфодиэфирных связей в своих собственных или др. молекулах РНК.

Определение первичной структуры (секвенирование) НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. Секвенирование НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. позволяет определить в одном эксперименте последовательность нуклеотидов в ДНК или РНК, содержащих несколько сотен мономерных звеньев. Методы основаны на общем принципе - определении с помощью высоко-разрешающего электрофореза в полиакриламидном геле с точностью до одного нуклеотида длины всех возможных фрагментов секвенируемого участка НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк., содержащих на одном конце одну и ту же последовательность нуклеотидов (гомогенный фрагмент), а на другом-один и тот же нуклео-тид. Такие фрагменты получают двумя различные способами. В первом случае (метод Максама-Гилберта) гомогенный фрагмент ДНК или РНК, предварительно меченный радиоактивной меткой по одному из концов, расщепляют химический агентами, специфичными к одному из четырех нуклеотидных остатков (A, G, С, Т или U); в случае РНК этот процесс осуществляют также специфический рибонуклеазами. Расщепление ведут в таких ограничивающих условиях, когда в каждой молекуле НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. расщепляется только одна меж-нуклеотидная связь рядом с нуклеотидом данного типа, независимо от его положения в цепи. Такую операцию проводят для каждого из четырех нуклеотидных остатков и по длинам образующихся радиоактивных фрагментов определяют положение каждого нуклеотида в цепи НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк.


В др. случае (м е т о д С е н г е р а) используют олиго- или полинуклеотидную затравку (праймер) известной длины, коплементарную определенному участку НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. Затравку наращивают с помощью ДНК-полимеразы, останавливая синтез на одном из четырех типов нуклеотидных остатков с равной вероятностью, независимо от его положения в цепи. Для этого к смеси четырех природные субстратов ДНК-полимеразы добавляют т.называют терминатор (обычно 2», 3»-ди-дезоксинуклеозидтрифосфат) - аналог определяемого нукле-отидного остатка, попадание которого на 3»-конец растущей цепи останавливает синтез. При этом радиоактивная метка вводится либо в затравку, либо в субстрат. Операцию повторяют для каждого из четырех нуклеотидов; длину образующихся радиоактивных фрагментов определяют стандартным способом. Эти методы в настоящее время удалось полностью автоматизировать (заменив в ряде случаев радиоактивную метку на флуоресцентную) и тем самым в тысячи раз повысить скорость секвенирования ДНК.

Получение НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. В клетках НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. связаны с белками, образуя нуклеопротеиды. Выделение НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. сводится преимущественно к очистке их от белков. Для этого препараты, содержащие НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк., обрабатывают ПАВ и экстрагируют белки фенолом. Послед, очистка и фракционирование НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. проводятся с помощью ультрацентрифугирования, различные видов жидкостной хрома-тографии и гель-электрофореза. Для получения индивидуальных НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. обычно используют различные варианты последнего метода.

Совр. методы химический синтеза НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. позволяют получать крупные фрагменты ДНК, в т.ч. целые гены. Методич. основы химический-ферментативных методов синтеза ДНК разработаны X. Кораной. Они включают: 1) химический синтез комплементарных, взаимоперекрывающихся олигонукле-отидов, из которых затем в результате комплементационных взаимодействие выстраиваются дуплексы - фрагменты молекулы синтезируемой ДНК с несовпадающими разрывами в обеих цепях; 2) соединение (лигирование) таких олигонуклеотидов в составе дуплекса с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы. Сборку протяженных ДНК из синтетич. однотяжевых олигонуклеотидов проводят в несколько этапов (рис. 4). Сначала (а) собирают небольшие дуплексы с "липкими" концами (одно-тяжевыми комплементарными участками), из которых затем последовательно (б, в и т. д.) формируют более протяженные структуры. Т. обр. могут быть получены искусств. фрагменты ДНК большой длины и с любой нуклеотидной последовательностью. С помощью генетич. инженерии возможно клонирование (получение в индивидуальном виде и размножение) искусств. ДНК.


Рис.4. Схема синтеза полидезоксинуклеотида: 1,- соответственно 5»- и 3»-конец олигонуклеотидов; 3-комплементарные участки концов дуплексов (:липкие: концы); а,б и в-стадии образования дуплексов (все стадии катализируются Т4 ДНК-лигазой).

Синтез олигодезоксинуклеотидов Корана осуществил так называемой фосфодиэфирным методом по схеме:


К динуклеотиду со свободный 3»-гидроксильной группой присоединяют таким же способом динуклеотид с незащищенной 5»-фосфатной группой и т.д. (т.называют блочный метод синтеза):


Несмотря на малую эффективность этого метода, были синтезированы олигонуклеотиды, содержащие до 16 звеньев, из которых были собраны первые синтетич. гены. Фосфоди-эфирный метод образования межнуклеотидных связей, использованный Кораной, имеет история, значение. Однако разработанные им приемы введения и избират. удаления защитных групп широко используются в др. методах синтеза НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк.

Важным шагом в совершенствовании синтеза олигонукле-отидов явилась разработка т.называют фосфотриэфирного метода, который осуществляют по схеме:


Образующийся динуклеотид далее (после частичного деблокирования фосфата) конденсируют аналогичным образом с другими динуклеотидом и т.д. Применение этого способа, в котором используют защиту фосфатной группы, позволило значительной сократить время синтеза и повысить выходы олиго-нуклеотидов.

Параллельно этим методам, которые осуществляют в растворах, разрабатывались твердофазные способы синтеза НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. В последнем случае процесс проводят в двухфазной системе; нуклеозидный компонент связан ковалентно с нерастворимым полимером, а нуклеотидный компонент и необходимые реагенты находятся в растворе.

Обычно в этом случае на первой стадии нуклеозид при соединяют с помощью "якорной" группы к нерастворимому полимеру. Затем его 5»-гидроксильную группу деблокируют и конденсируют с нуклеотидным компонентом. У образующегося полностью защищенного динуклеозидмонофосфата деблокируют защитную группу в положении 5» и присоединяют следующей нуклеотид и т.д.

Наиб. распространенные методы твердофазного синтеза олигонуклеотидов основаны на использовании нуклеотидного компонента, содержащего Р(III). В т.называют амидофосфитном-способе (рис. 5) нуклеотидным компонентом является эфир 3»-амидофосфита дезоксинуклеозида. Достаточно устойчивые амидофосфиты при протонировании в присутствии тетразола превращаются в сильные фосфорилирующие агенты. Схема также включает блокирование непрореагировавшей 3»-гидрокси группы достраивающегося олигонуклеотида (кэпирование) и окисление межнуклеотидного фосфита. На рис. показан один цикл наращивания цепи, который длится 5-7 мин и далее повторяется. После завершения синтеза удаляют защитные группы с межнуклеотидных фосфатов, отделяют олигонуклеотид от носителя, деблокируют группы NH2 гетероциклов. Липофильную группу (МеО)2Тr удаляют после первого хроматографич. разделения.

Рис. 5. Схема твердофазного синтеза олигонуклеотидов амидофосфитным методом; П - полимерный носитель, Ру- пиридин.



Др. метод основан на использовании гидрофосфориль-ного производного нуклеозида:


П-полимерный носитель

После снятия 5»-защитной диметокситритильной группы возможно присоединение следующей нуклеотида. Окисление межнуклеотидных фосфитных групп проводят после завершения синтеза олигонуклеотида.

Стандартность операций в твердофазном синтезе олиго-нуклеотидов явилась основой для автоматизации процесса. Принцип работы автомата-синтезатора основан на подаче в реактор с помощью насоса (под контролем микропроцессора) защищенных нуклеотидных компонентов реагентов и растворителей по заданной программе в колонку, содержащую полимерный носитель с закрепленным на нем первым нукле-озидом. После окончания синтеза и отделения полностью защищенного олигонуклеотида от полимерного носителя проводят деблокирование, очистку и анализ синтезир. фрагментов ДНК. Так, с помощью гидрофосфорильного метода

в автомате-синтезаторе за несколько часов получают 30-40-звен-ные олигонуклеотиды; возможен синтез более чем 100-звен-ных фрагментов ДНК. Разработаны синтезаторы, позволяющие проводить одновременно синтез несколько олигонукле-отидов.

Синтез олигорибонуклеотидов ферментативным путем осуществляют обычно с использованием рибонуклеаз (РНаз) или полинуклеотидфосфорилаз (ПНФаз). В первом случае реакцию осуществляют по схеме:


R-H или остаток олигорибонуклеотида

В качестве нуклеотидного и нуклеозидного компонентов применяют мономеры или олигонуклеотиды. Эту реакцию используют для синтеза ди-, три- и тетрарибонуклеотидов. При увеличении длины олигорибонуклеотида начинает преобладать обратная реакция (гидролиз олигонуклеотида).

Для синтеза олигорибонуклеотидов с большим числом звеньев используют ПН Фазу:


РР-Остаток пирофосфорной н-ты

Химическая синтез олигорибонуклеотидов проводят в основные с использованием тех же приемов, как и при синтезе ДНК. Дополнит. трудности связаны с селективной защитой 2»-гидроксигруппы рибозы, а также с неустойчивостью фос-фодиэфирной связи РНК в щелочной среде.

Длинные фрагменты РНК получают из коротких, соединяя их с помощью РНК-лигазы.

Историческая справка. Н.к. открыты в 1869-72 Ф. Мише-ром в ядрах (отсюда назв.: лат. nucleus-ядро) клеток гноя и в сперме лосося. В 1889 Р. Альтман выделил их в чистом виде (им же предложен термин "Н.к."). В 1944 О. Эйвери показал, что с помощью ДНК наследств. признаки может быть переданы от одной клетки к другой и что ДНК, т. обр., является "в-вом наследственности". Химическая строение НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. изучалось школами А. Косселя, П. Левина, Дж. Гулленда и А. Тодда и было окончательно установлено к нач. 50-х гг. Макромол. структура ДНК (двойная спираль) установлена в 1953 Дж. Уотсоном и Ф. Криком на основании данных рентгеноструктурного анализа, полученных Р. Франклин и М. Уилкинсом. Нуклеотидный состав ДНК и РНК из многих объектов изучен Э. Чаргаффом и А. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ Белозерским в 40-50-х гг. Изучение первичной структуры НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ к. начато с сер. 60-х гг. с установления нуклеотидной последовательности тРНК (Р. Холли). Функции большинства РНК установлены к нач. 60-х гг. Было показано, что они участвуют в реализации генетич. информации, закодированной в ДНК.

П. Доти и А. С. Спириным исследовано макромол. строение РНК. В сер. 70-х гг. разработаны эффективные методы расшифровки первичной структуры ДНК и РНК (методы Максама-Гилберта и Сенгера), которые в сочетании с методами генетич. инженерии позволили в течение следующей десятилетия определить нуклеотидные последовательности многие генов, плазмид, вирусных ДНК и РНК, рРНК и др. Разработаны приемы обработки этой информации с использованием ЭВМ. В 70-х гг. Кораной разработаны методы синтеза ДНК; им впервые синтезированы природные гены (аланиновой и тиразиновой транспортных РНК). Начиная с сер. 70-х гг. создавались методы получения рекомбинантных НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. (образуются, например, в результате встраивания участка ДНК, в т.ч. гена, в плазмиду; см. Генетическая инженерия), которые существенно расширили возможности структурно-функцион. исследований НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк. и создали базу для использования достижений мол. биологии и генетики в биотехнологии. В 80-е гг. разработаны эффективные методы химического (в т.ч. автоматического) синтеза олигонуклеотидов и крупных фрагментов ДНК, которые широко используют для изучения структуры и функций НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫк.

Литература: Шабарова 3. А., Богданов А. А., Химия нуклеиновых кислот и их компонентов, М., 1978; Страйер Л., Биохимия, пер. с англ., т. 3, М., 1985; Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д., Рекомбинантные ДНК, пер. с англ., М., 1986; Зенгер В., Принципы структурной организации нуклеиновых кислот, пер. с англ., М., 1987; Овчинников Ю.А., Биоорганическая химия, М., 1987, с. 295-397. А. А. Богданов, 3. А. Шабарова.



Химическая энциклопедия. Том 3 >> К списку статей


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]    [обратная связь]

 

 

Реклама
бокс для хранения вещей аренда
Самое выгодное предложение от магазина компьютерной техники КНС Нева - какой марки ноутбук лучше купить - более 10 лет на рынке, Санкт-Петербург, Пушкинская, ул. Рузовская, д.11.
майки на автомобильные сиденья
дельфин в нижнем новглроде концерт

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)