химический каталог




БЕЛКИ

Автор Химическая энциклопедия г.р. И.Л.Кнунянц

БЕЛКИ, высокомол. природные полимеры, построенные из остатков аминокислот, соединенных амидной (пептидной) связью —СО—NH—. Каждый БЕЛКИ характеризуется специфический аминокислотной последовательностью и индивидуальной пространств, структурой (конформацией). На долю БЕЛКИ приходится не менее 50% сухой массы органическое соединение животной клетки. Функционирование БЕЛКИ лежит в основе важнейших процессов жизнедеятельности организма. Обмен веществ (пищеварение, дыхание и др.), мышечное сокращение, нервная проводимость и жизнь клетки в целом неразрывно связаны с активностью ферментов - высокоспецифический катализаторов биохимический реакций, являющихся белками. Основу костной и соединительной тканей, шерсти, роговых образований составляют структурные БЕЛКИ (см., например, Коллаген). Они же формируют остов клеточных органелл (митохондрий, мембран и др.). Расхождение хромосом при делении клетки, движение жгутиков, работа мышц животных и человека осуществляются по единому механизму при посредстве БЕЛКИ сократительной системы (см., например, Актин, Миозин). Важную группу составляют регуляторные белки, контролирующие биосинтез БЕЛКИ и нуклеиновых кислот. К регуляторным Б. относятся также пептидно-белковые гормоны, которые секретируются эндокринными железами. Информация о состоянии внешний среды, различные регуляторные сигналы (в том числе гормональные) воспринимаются клеткой с помощью спец. рецепторных белков, располагающихся на наружной поверхности плазматических мембраны. Эти Б. играют важную роль в передаче нервного возбуждения и в ориентированном движении клетки (хемотаксисе). В активном транспорте ионов, липидов, Сахаров и аминокислот через биологическое мембраны участвуют транспортные БЕЛКИ, или белки-переносчики. К последним относятся также гемоглобин и миоглобин, осуществляющие перенос кислорода. Преобразование и утилизация энергии, поступающей в организм с питанием, а также энергии солнечного излучения происходят при участии Б. биоэнергетич. системы (например, родопсин, цитохромы). Большое значение имеют пищевые и запасные белки (см., например, Казеин, Проламины), играющие важную роль в развитии и функционировании организмов. Защитные системы высших организмов формируются защитными БЕЛКИ, к к-рым относятся иммуноглобулины (ответственны за иммунитет), БЕЛКИ комплемента (ответственны за лизис чужеродных клеток и активацию иммунологич. функции), БЕЛКИ системы свертывания крови (см., например, Тромбин, Фибрин)и противовирусный БЕЛКИ интерферон.

По составу БЕЛКИ делят на простые, состоящие только из аминокислотных остатков, и сложные. Сложные могут включать ионы металла (металлопротеиды) или пигмент (хромопротеиды), образовывать прочные комплексы с липидами (липопротеины), нуклеиновыми кислотами (нуклеопротеиды), а также ковалентно связывать остаток фосфорной кислоты (фосфопротеиды), углевода (гликопротеины)или нуклеиновой кислоты (геномы некоторых вирусов). В соответствии с формой молекул БЕЛКИ подразделяют на глобулярные и фибриллярные. Молекулы первых свернуты в компактные глобулы сферич. или эллипсоидной формы, молекулы вторых образуют длинные волокна (фибриллы) и высокоасимметричны. Большинство глобулярных БЕЛКИ, в отличие от фибриллярных, растворимы в воде. Особую группу составляют мембранные (амфипатические) БЕЛКИ, характеризующиеся неравномерным распределением гидрофильных и гидрофобных (липофильных) участков в молекуле: погруженная в биологическое мембрану часть глобулы состоит преимущественно из липофильных аминокислотных остатков, а выступающая из мембраны - из гидрофильных.

Историческая справка. Первые работы по выделению и изучению белковых препаратов были выполнены еще в 18 в., однако в тот период исследования Б. носили описательный характер. В нач. 19 в. были сделаны первые анализы элементного состава БЕЛКИ (Ж. Л. Гей-Люссак, Л. Ж. Тенар, 1810), положившие начало систематич. аналит. исследованиям, в результате которых было установлено, что все белковые вещества близки не только по внешний признакам и свойствам, но и по элементному составу. Важное следствие этих работ - создание первой теории строения белковых веществ (Г.Я. Мульдер, 1836), согласно которой все БЕЛКИ содержат общий гипотетич. радикал - "протеин", имеющий эмпирическая формулу C40H62N10O12 и связанный в различные пропорциях с атомами серы и фосфора. Получив вначале всеобщее признание, эта теория привлекла интерес к аналит. исследованиям Б., совершенствованию препаративных методов белковой химии. В этот период были разработаны простейшие приемы выделения БЕЛКИ путем экстракции растворами нейтральных солей и осаждения, получены первые кристаллич. БЕЛКИ (гемоглобин, некоторые растит. БЕЛКИ), для анализа БЕЛКИ стали использовать кислотный и щелочной гидролиз.

Создание теории протеина совпало по времени с формированием представлений о функции БЕЛКИ в организме. В 1835 Й.Я. Бёрцедиус высказал идею о важнейшей функции БЕЛКИ- биокаталитической. Вскоре были открыты первые протеолитич. ферменты - пепсин (Т. Шмнн._1836) и трипсин (Л. Корвизар, 1856). Открытие протеаз стимулировало интерес биохимиков к физиологии пищеварения, а следовательно, и к продуктам переваривания БЕЛКИ К сер. 19 в. было показано, что под действием протеолитич. ферментов БЕЛКИ распадаются на близкие по свойствам фрагменты, получившие назв. пептонов (К. Леман, 1850).

Важное событие в изучении БЕЛКИ - выделение из белкового гидролизата аминокислоты глицина (А. Браконно, 1820). К кон. 19 в. было изучено большинство аминокислот, входящих в состав БЕЛКИ, синтезирован аланин (А. Штреккер, 1850). В 1894 А. Косеелъ высказал идею о том, что основные структурными элементами БЕЛКИ являются аминокислоты.

В нач. 20 в. значительной вклад в изучение БЕЛКИ был внесен Э. Фишером, .впервые применившим для этого методы органическое химии. Путем встречного синтеза Э. Фишер доказал, что БЕЛКИ построены из остатковаминокислот, связанных амидной (пептидной) связью. Он также выполнил первые аминокислотные анализы БЕЛКИ, дал правильное объяснение протеолизу.

В 20-40-е гг. получили развитие физических-химический методы анализа БЕЛКИ Седиментационными и диффузионными методами были определены молекулярной массы многих БЕЛКИ, получены данные о сферич. форме молекул глобулярных БЕЛКИ (Т. Сведберг, 1926), выполнены первые рентгеноструктурные анализы аминокислот и пептидов (Дж. Д. Бернал, 1931), разработаны хроматографич. методы анализа (А. Мартин, Р. Синг, 1944). Существенно расширились представления о функциональной роли БЕЛКИ: был выделен первый белковый гормон - инсулин (Ф. Бантинг, Ч. Г. Бест, 1922), антитела были идентифицированы как фракцияглобулинов (1939) и тем самым обнаружена новая функция БЕЛКИ - защитная. Важным этапом явилось открытие ферментативной функции мышечного миозина (В. А. Энгельгардт, М.Н.Любимова, 1939) и получение первых кристаллич. ферментов (уреазы-Дж.Б. Салшер, 1926; пепсина - Дж.X. Нортроп, 1929; лизоцима - Э. П. Абрахам, Р. Робинсон, 1937).

В нач. 50-х гг. была выдвинута идея о трех уровнях организации белковых молекул (К. У. Линдерстрём-Ланг, 1952) - первичной, вторичной и третичной структурах. Определены первичные структуры инсулина (Ф. Сенгер, 1953) и рибонуклеазы (К. Анфинсен, С. Мур, К. Хёрс, У. Стайн, 1960). По данным рентген ©структурного анализа были построены трехмерные модели миоглобина (Дж. Кендрю, 1958) и гемоглобина (М, Перуц, 1958) и, т. обр., доказано существование в БЕЛКИ вторичной и третичной структур, в том числе спирали, предсказанной Л. Допингом и Р. Кори в 1949-51.

В 60-е гг. в химии БЕЛКИ интенсивно развивалось синтетич. направление: были синтезированы инсулин (X. Цан, 1963, П. Кадоянис, 1964, Ю. Ван и др., 1965) и рибонуклеаза А (Б. Меррифидд, 1969). Дальнейшее развитие получили аналит. методы: стал широко использоваться автоматич. аминокислотный анализатор, созданный С. Муром и У. Стайном в 1958, существенно модифицированы хроматографич. методы, до высокой степени совершенства доведен рентгеноструктурный анализ, сконструирован автоматич. прибор для определения последовательности аминокислотных остатков в БЕЛКИ - секвенатор (П. Эдман, Г. Бэгг, 1967). Благодаря созданию прочной методич. базы стало возможным проводить широкие исследования аминокислотной последовательности БЕЛКИ В эти годы была определена структура несколько сотен сравнительно небольших БЕЛКИ (до 300 аминокислотных остатков в одной цепи), полученных из самых различные источников как животного, так и растит., бактериального, вирусного и др. происхождения. Среди них — протеолитич. ферменты (трипсин, химотрипсин, субтилизин, карбоксипептидазы), миоглобины, гемоглобины, цитохромы, лизоцимы, иммуноглобулины, гистоны, нейротоксины, БЕЛКИ оболочек вирусов, белково-пептидные гормоны и др. В результате были созданы предпосылки для решения актуальных проблем энзимологии, иммунологии, эндокринологии и др. областей физических-химический биологии.

В 70-80-е гг. наиболее прогресс был достигнут при изучении БЕЛКИ - регуляторов матричного синтеза биополимеров (в т.ч. БЕЛКИ рибосом), сократительных, транспортных и защитных БЕЛКИ, ряда мембранных БЕЛКИ (в том числе БЕЛКИ биоэнергетич. систем), рецепторных Б. Большое внимание уделялось дальнейшему совершенствованию методов анализа Б. Значительно повышена чувствительность автоматич. анализа аминокислотной последовательности БЕЛКИ (Б. Витман-Либольд, Л. Худ). Широкое применение нашли новые методы разделения БЕЛКИ и пептидов (жидкостная хроматография высокого давления, биоспецифический хроматография). В связи с разработкой эффективных методов анализа нуклеотидной последовательности ДНК (А. Максам и У. Гилберт, Ф. Сенгер) стало возможным использовать полученную при таком анализе информацию и при определении первичной структуры БЕЛКИ В результате установлена структура ряда БЕЛКИ, доступных в ничтожно малых кол-вах (интерферон, ацетилхолиновый рецептор), а также БЕЛКИ большой молекулярной массы (фактор элонгации G, гликогенфосфорилаза,галактозидаза, коллаген, исубъединицы РНК-полимеразы, содержащие соответственно 701, 841, 1021, 1028, 1342 и 1407 аминокислотных остатков). Успехи структурного анализа позволили вплотную приступить к определению пространств, организации и молекулярных механизмов функционирования надмолекулярных комплексов, в т.ч. рибосом, хроматина (нуклеосом), митохондрий, фагов и вирусов. Существ, результаты получены в эти годы советскими учеными: определена первичная структура аспартатаминотрансферазы (1972), бактериородопсина (1978), животного родопсина (1982), некоторых рибосомальных БЕЛКИ, фактора элонгации G (1982), важнейшего фермента-РНК-полимеразы (1976-82), нейротоксинов и др.

Строение белковых молекул. Практически все БЕЛКИ построены из 20аминокислот, принадлежащих, за исключением глицина, к L-ряду. Аминокислоты соединены между собой пептидными связями, образованными карбоксильной иаминогруппами соседних аминокислотных остатков (см. формулу I):

Белковая молекула может состоять из одной или несколько цепей, содержащих от 50 до несколько сотен (иногда - более тысячи) аминокислотных остатков. Молекулы, содержащие менее 50 остатков, часто относят к пептидам. В состав многие молекул входят остатки цистина, дисульфидные связи которых ковалентно связывают участки одной или несколько цепей.

В нативном состоянии макромолекулы БЕЛКИ обладают специфический конформацией. Характерная для данного БЕЛКИ конформация определяется последовательностью аминокислотных остатков и стабилизируется водородными связями между пептидными и боковыми группами аминокислотных остатков, а также гидрофобными и электростатич. взаимодействиями. Большое влияние на конформацию оказывают взаимодействие БЕЛКИ с компонентами среды (вода, липиды и др.), в которой они функционируют.

Различают четыре уровня организации белковых молекул. Последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи называют первичной структурой. Все БЕЛКИ различаются по первичной структуре; потенциально возможное их число практически неограничено. Термин "вторичная структура" относится к типу укладки полипептидных цепей. наиболее часто встречающиеся типы-правая спираль иструктура. Первая характеризуется планарностью пептидной группы; водородные связи между СО-и NH-группами пептидной цепи замыкают циклы из 13 атомов (рис. 1). На 1 витокспирали приходится 3,6 остатка аминокислот, шаг спирали -0,544 нм. Значительно менее энергетически выгодны правые 310- испирали, содержащие соответственно 3 и 4,4 аминокислотных остатка на 1 виток, а также 10 и 16 атомов в циклах, образованных водородными связями. 310-Спирали встречаются сравнительно редко и образуют только очень короткие участки, которые обычно располагаются на концахспиралей. Предсказанные теоретически правыеспирали, а также левые 310- испирали в БЕЛКИ не обнаружены.

В случаеструктуры, или структуры складчатого листа, полипептидные цепи растянуты, уложены параллельно друг другу и связаны между собой водородными связями. Остов цепи не лежит в одной плоскости, а вследствие небольших изгибов приуглеродных атомах образует слегка волнистый слой. Боковые группы располагаются перпендикулярно плоскости слоя. В БЕЛКИ обнаружены два видаструктуры: с параллельным и антипараллельным направлениями цепей (рис. 2). Частный случайструктуры-изгиб, обеспечивающий поворот пептидной цепи на угол ок. 180° на протяжении отрезка, содержащего 4 аминокислотных остатка; 1-й и 4-й остатки соединены водородной связью. Относительное содержаниеспиральных участков и структур может широко варьировать. Существуют БЕЛКИ с преобладаниемспиралей (ок. 75% в миоглобине и гемоглобине), тогда как основные тип структуры многих фибриллярных БЕЛКИ, в т.ч. фиброина шелка и кератина волос,-структура. У многих БЕЛКИ содержание иструктурных участков незначительно, однако и в этих случаях полипептидные цепи укладываются в пространстве строго определенным, характерным для каждого БЕЛКИ образом.

Под третичной структурой БЕЛКИ понимают расположение его полипептидной цепи в пространстве. Существ. влияние на формирование третичной структуры оказывают размер, форма и полярность аминокислотных остатков. В молекулах глобулярных БЕЛКИ большая часть гидрофобных остатков скрыта внутри глобулы, а полярные группировки располагаются на ее поверхности в гидратированном состоянии. Однако ситуация не всегда настолько проста. Связывание белка с др. молекулами, например фермента с его субстратом или коферментом, почти всегда осуществляется с помощью небольшого гидрофобного участка на поверхности глобулы. Область контакта мембранных БЕЛКИ с липидами формируется преимущественно гидрофобными остатками. Третичная структура многих БЕЛКИ составляется из нескольких компактных глобул, называют доменами (рис. 3). Между собой домены обычно бывают связаны "тонкими перемычками" - вытянутыми полипептидными цепями. Пептидные связи, расположенные в этих цепях, расщепляются в первую очередь при обработке БЕЛКИ протеолитич. ферментами, тогда как отдельные домены может быть достаточно устойчивы к протеолизу.

Рис. I. Спиральные конформации полипептидных цепей: а-310-спираль, б- спираль, в-спираль (пунктирные линии-водородные связи).

Рис. 2. Схематич. изображениеструктур: слева - антипараллельный, справа - параллельный складчатый лист.

Рис. 3. Схематич. изображение трехмерной структуры малатде-гидрогеназы. Участкиспиралей (от до) иструктур (от до) представлены соответственно в виде прямоугольников и прямых линий со стрелками. Структура состоит из двух отчетливо различимых глобулярных областей (доменов). Участок полипептидной цепи, соединяющий домены между собой, показан точечной линией.

Термин "четвертичная структура" относится к макромолекулам, в состав которых входит несколько полипептидных цепей (субъединиц), не связанных между собой ковалентно. Такая структура отражает способ объединения и расположения этих субъединиц в пространстве. Между собой отдельные субъединицы соединяются водородными, ионными, гидрофобными и др. связями. Изменение рН и ионной силы раствора, повышение температуры или обработка детергентами обычно приводят к диссоциации макромолекулы на субъединицы. Этот процесс обратим: при устранении факторов, вызывающих диссоциацию, может происходить самопроизвольная реконструкция исходной четвертичной структуры. Явление носит общий характер: по принципу самосборки функционируют многие биологическое структуры. Способность к самосборке свойственна и отдельным фрагментам БЕЛКИ - доменам. Более глубокие изменения конформации БЕЛКИ с нарушением третичной структуры называют денатурацией.

Свойства. Физ.-химический свойства БЕЛКИ определяются их высокомол. природой, компактностью укладки полипептидных цепей и взаимным расположением остатков аминокислот. Молекулярная масса варьирует от 5 тыс. до 1 млн., а константы седиментации - от 1 до 20 (и выше). Средний удельная объем белковых молекул - 0,70-0,75 см3/г, а константы диффузии - 106-108 см2/с. Максимум поглощения БЕЛКИ в УФ-области спектра, обусловленный наличием ароматические аминокислот, находится вблизи 280 им. Возбуждение электронов атома азота пептидной группы вызывает резкое увеличение поглощения при 185-240 нм. В ИК-области спектра БЕЛКИ поглощают за счет СО- и NH-rpyпп при 1600 и 3100-3300 см-1.

В растворах БЕЛКИ амфотерны. Изоэлектрич. точки БЕЛКИ могут иметь значения от < 1,0 (у пепсина) до 10,6 (у цитохрома с) и выше. Боковые группы аминокислотных остатков способны вступать во многие реакции. БЕЛКИ дают ряд цветных реакций, обусловленных наличием определенных аминокислотных остатков или химический группировок. К важнейшим из них относятся: биуретовая реакция (пептидные связи), ксантопротеиновая реакция (ароматические ядра остатков тирозина, триптофана, фенилаланина), Адамкевича реакция (индольное кольцо триптофана), Мил лона реакция (фенольный радикал тирозина), Паули реакция (имидазольное кольцо гистидина), Сакагучи реакция (гуанидиновая группа аргинина) и нингидриновая реакция (аминогруппа).

Выделение. Один из первых этапов выделения БЕЛКИ - получение соответствующих органелл (рибосом, митохондрий, ядер, цитоплазматических мембраны) с помощью дифференциального центрифугирования. Далее БЕЛКИ переводят в растворимое состояние путем экстракции буферными растворами солей и детергентов, иногда - неполярными растворителями. Затем применяют фракционное осаждение неорганическое солями [обычно (NH4)2SO4], этанолом, ацетоном или путем изменения рН, ионной силы, температуры. Для предотвращения денатурации работу проводят при пониж. температуре (ок. 4°С); с целью исключения протеолиза используют ингибиторы протеаз, некоторые БЕЛКИ стабилизируют полиолами, например глицерином. Дальнейшую очистку проводят по схемам, специально разработанным для отдельных Б. или группы гомологичных БЕЛКИ наиболее распространенные методы разделения-гель-проникающая хроматография, ионообменная и адсорбционного хроматография; эффективные методы-жидкостная хроматография высокого разрешения и аффинная хроматография.

Критерий чистоты БЕЛКИ - гомогенность при электрофорезе, хроматографии и ультрацентрифугировании. Одноцепо-чечный БЕЛКИ должен быть гомогенным при N- и С-концевом анализе (см. ниже). Примесь сопутствующих ферментов определяют с помощью специфический субстратов; высокую чувствительность имеют иммунохимический методы (обычно до 10-3 мкг/мл примесного антигена).

Методы исследования первичной структуры. Знание первичной структуры Б.-основа для определения его вторичной и третичной структур, выяснения расположения функциональных групп в активном центре БЕЛКИ и построения модели его функционирования. Исследование первичной структуры мутантных БЕЛКИ позволяет на молекулярном уровне характеризовать различия между штаммами микроорганизмов, фагов и вирусов, выяснять молекулярные причины генетич. болезней. Данные по первичной структуре используют при установлении и проверке таксономич. взаимоотношений между различные видами живых организмов, построении фило-генетич. древа и анализе хода биологическое эволюции.

Для определения аминокислотной последовательности БЕЛКИ прежде всего разделяют его полипептидные цепи (если макромолекула состоит из нескольких цепей). Затем определяют аминокислотный состав цепей, N- и С-концевые аминокислотные остатки и аминокислотные последовательности. Полипептидные цепи подвергают специфический расщеплению протеолитич. ферментами или химический реагентами. Смесь образовавшихся фрагментов разделяют и для каждого из них определяют аминокислотный состав и аминокислотную последовательность. При необходимости крупные фрагменты дополнительно расщепляют к.-л. способом на более мелкие. Порядок расположения фрагментов выясняют путем расщепления молекулы БЕЛКИ по др. связям и анализа образующихся при этом "перекрывающихся" фрагментов.

Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого Б. или пептида и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Для гидролиза обычно используют 5,7 н. водный раствор НCl, а при анализе содержания триптофана - 4 н. метансульфоновую кислоту, содержащую 0,2% 3-(2-аминоэтил)индола, или кипячение со щелочью. Количеств. определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких приборов смесь аминокислот разделяют на ионообменных колонках, детекцию осуществляют спектрофотометрически по реакции с нингидрином или флуориметрически с использованием флуорескамина или о-фталевого диальдегида. В последнем случае можно анализировать до 0,1-0,05 нмоль аминокислоты.

Наиб. распространение для определения N-концевых остатков находит дансильный метод. Его первая стадия -присоединение дансилхлорида (1-диметиламинонафталин-5-сульфохлорида) к непротонированнойаминогруппе с образованием дансилпептида (ДНС-пептида). Затем последний гидролизуют 5,7 н. раствором НCl при 105 °С, в результате чего освобождается N-концеваяДНС-аминокислота, которая обладает интенсивной флуоресценцией в УФ-области спектра; для ее идентификации достаточно 0,1-0,5 нмоля вещества.

Для определения С-концевых остатков чаще всего используют ферментативный гидролиз карбоксипептидазами, которые специфически расщепляют пептидные связи, образованные С-концевыми остатками. Поскольку после отщепления концевых остатков фермент атакует последующей пептидные связи, измерение скорости отщепления отдельных аминокислот позволяет анализировать также и С-концевую аминокислотную последовательность.

Важнейший этап в определении первичной структуры БЕЛКИ - расщепление макромолекулы на пептидные фрагменты. Среди ферментативных методов расщепления наиболее широко используется гидролиз трипсином. Трипсин обладает уникальной субстратной специфичностью: гидролизует исключительно связи, образованные карбоксильными группами основные аминокислот - лизина и аргинина. Введение заместителей в боковые цепи лизина или аргинина препятствует гидролизу по остаткам модифициров. аминокислот и позволяет гидролизовать макромолекулы избирательно только по остаткам аргинина или лизина. Особенно часто используется модификация остатков лизина с последующей гидролизом БЕЛКИ по остаткам аргинина. Модифицирующие агенты - ангидриды дикарбоновых кислот (янтарной, малеиновой и цитраконовой). Из др. протеолитич. ферментов широко применяется протеаза из Staphylococcus aureus (гидролизует связи, образованные карбоксильными группами остатков глутаминовой кислоты, а в некоторых случаях и остатков аспарагиновой кислоты), а также химотрипсин и термолизин. Последние ферменты обладают более широкой специфичностью. Химотрипсин катализирует гидролиз пептидных связей, образованных карбоксильными группами ароматические аминокислот - тирозина, фенилаланина и триптофана. С меньшей скоростью гидролизуются связи лейцина, метионина и гистидина. Термолизин преимущественно расщепляет связи, образованные аминогруппой остатков с гидрофобной боковой цепью (изолейцин, лейцин, валин, фенилаланин, тирозин, триптофан).

Из химических методов расщепления БЕЛКИ наиболее специфичный и чаще всего применяемый -бромциановое расщепление по остаткам метионина (выход 90-100%):

Для расщепления БЕЛКИ по карбонильной группе остатка триптофана используют N-бромсукцинимид или более селективный 2-(2-нитрофенилсульфенил)-3-метил-3-броминдол (BNPS-скатол) (выход Ю-50%):

Гидроксиламин расщепляет пептидные связи между остатками аспарагина и глицина. При его взаимодействие с циклический имидом ангидроаспартилглицина, спонтанно образующегося из аспарагинилглицина, в щелочной среде происходит расщепление пептидной цепи с образованием смеси иаспартилгидроксаматов:

В ряде случаев для расщепления БЕЛКИ используется метод частичного кислотного гидролиза. наиболее чувствительны к действию кислот аспартильные пептидные связи и особенно связь аспартил - пропил.

При выборе методов разделения пептидов учитывают физических-химический свойства, количество и длину молекул разделяемых соединений. Для первичного фракционирования смесей коротких пептидов, содержащих до 15-20 аминокислотных остатков, в большинстве случаев используют ионообменную хроматографию на катионитах. Дальнейшее разделение и очистку проводят с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге или пластинках с тонким слоем целлюлозы или силикагеля.

Осн. сложность при фракционировании молекул крупных пептидов (более 20 аминокислотных остатков) - их свойство слипаться в водных растворах друг с другом с образованием высокомол. агрегатов, не поддающихся разделению. Для предотвращения агрегации в буферные растворы вводят мочевину (до 8 М), гуанидинийхлорид (до 6 М) или детергенты (додецилсульфат Na); разделение часто проводят с помощью гель-проникающей хроматографии и ионообменной хроматографии. Эффективный метод разделения - жидкостная хроматография высокого разрешения на носителях с обращенной фазой. Для селективного выделения пептидов, несущих химически активные группировки, может быть использована хемоспецифический (ковалентная) хроматография, основанная на образовании ковалентной связи пептида с носителем. Например, для выделения цистеинсодержащих пептидов используют реакцию тиол-дисульфидного обмена, с помощью которой пептиды через дисульфидный мостик присоединяются к модифицированному 2,2"-дипиридилдисульфидом носителю. Ковалентно связанные с носителем цистеинсодержащие пептиды может быть легко элюированы при последующей обработке меркаптоэтанолом.

Осн. метод исследования аминокислотной последовательности пептидов и Б. - химический деградация с помощью фенилизотиоцианата. Этот метод позволяет последовательно отщеплять N-концевые аминокислотные остатки в виде фенилтиогидантоинов, которые абсорбируют свет в УФ-области с максимумом поглощения 265-270 нм. Для их идентификации наиболее часто используют тонкослойную хроматографию, жидкостную хроматографию высокого давления, а также масс-спектрометрию. Широкое применение нашел также метод, сочетающий последовательную деградацию пептида по Эдману (см. Эдмана деградация) с анализом N-концевых аминокислотных остатков в виде их дансильных производных. Достоинство метода -его высокая чувствительность.

Для непосредственного анализа первичной структуры БЕЛКИ обычно используют секвенатор - прибор, который с высокой эффективностью осуществляет последовательное авто-матич. отщепление N-концевых аминокислотных остатков путем деградации Б. по методу Эдмана. Все реакции проводятся в цилиндрич. стеклянном стаканчике, вращающемся с постоянной скоростью в атмосфере инертного газа (рис. 4). Образец БЕЛКИ распределяется на стенках стаканчика в виде тонкой пленки. Оптимизация процесса и тщательная очистка используемых реагентов и растворителей позволили поднять общий выход реакции до 95% и выше. Наилучшие объекты для секвенатора - БЕЛКИ и пептиды, содержащие в своем составе от 60 до 200 аминокислотных остатков; для таких соединений обычно удается определять последовательность 30-35 (в ряде случаев 40-50) остатков. Для анализа коротких пептидов более эффективен подход, заключающийся в их ковалентном присоединении к нерастворимому носителю. Этот принцип положен в основу твердофазного секвенатора, где реакционное "сосудом" служит хроматографич. колонка, с носителем которой ко валентно связан исследуемый пептид. Через колонку последовательно пропускают реагенты и растворители. Носителями чаще всего служат полистирол и пористое стекло. В качестве функциональных группы, реагирующей с пептидом, обычно используется алифатич. или ароматические аминогруппа. Для присоединения к носителю пептидов, образующихся в результате бромцианового расщепления, используют высокую реакционное способность С-концевого лактона гомосерина. Лизинсодержащие пептиды может быть присоединены за счетаминогруппы путем конденсации с n-фенилендиизотиоцианатом. Остальные пептиды присоединяют по С-концевой карбоксильной группе карбодиимидным методом. Третье поколение приборов - газофазные секвенаторы, в которых образец наносится на небольшой (диаметр ок. 5 мм) диск из пористого стеклянного волокна, а все реагенты подаются в газовой фазе. Таким способом анализируют микроколичество вещества ( < 100 пкмоль).

Рис. 4. Схема реакционное камеры секвенатора.

При определении аминокислотной последовательности пептидов находит применение также масс-спектрометрия. В этом случае используется способность ионизиров. молекул пептидов распадаться по так называемой аминокислотному типу фрагментации, заключающемуся в разрыве СО—NH или —СО связей:

Идентификация в масс-спектре пиков, соответствующих фрагментам А1...Апили а1...ап, дает информацию о строении пептида.

Наиб. сложные проблемы возникают при изучении первичной структуры мембранных Б., а также БЕЛКИ, выделяемых в ничтожно малых кол-вах или имеющих большую мол. массу (> 100000). Ряд этих проблем решен благодаря разработке быстрых и эффективных методов анализа нуклеотидной последовательности ДНК. Поскольку первичная структура любого БЕЛКИ закодирована в нуклеотидной последовательности соответствующего ей участка ДНК, то определение последней позволяет с помощью генетич. кода автоматически устанавливать и соответствующую аминокислотную последовательность. При этом оказалось особенно эффективным параллельное изучение первичных структур БЕЛКИ и ДНК. Такой подход резко ускоряет проведение исследований и значительно повышает достоверность результатов.

Методы изучения пространственной структуры. При изучении пространств. структуры БЕЛКИ существует два принципиальных подхода: исследование в растворе и в кристаллич. состоянии. Осн. метод, дающий непосредственную информацию о пространств. расположении атомов в молекуле БЕЛКИ, - рентгеноструктурный анализ. Он применим только для хорошо кристаллизующихся БЕЛКИ При этом наряду с кристаллом нативного БЕЛКИ необходимо получать производные, содержащие тяжелые атомы, которые были бы изоморфными исходному БЕЛКИ, т.е. давали бы подобные кристаллич. структуры. Тяжелый атом вводится в молекулу БЕЛКИ при "вымачивании" кристалла в соответствующем растворе или в процессе кристаллизации. Иногда используют химический модификацию БЕЛКИ, например n-хлормеркурийбензоатом по SH-группам.

Интерпретация карт электронной плотности молекулы значительно облегчается при знании аминокислотной последовательности. Однако далеко не каждый БЕЛКИ удается получить в кристаллич. состоянии. Необходимое условие кристаллизации - сохранение нативной конформации, которая часто реализуется лишь в условиях, приближенных к физиологическим. В частности, БЕЛКИ, входящие в состав нуклеопротеидных комплексов (рибосома, вирусы), хорошо кристаллизуются только в составе таких комплексов. С помощью обычного рентгеновского излучения проводить анализ таких гигантских образований сложно. В этих случаях используют синхротронное рентгеновское излучение, интенсивность которого может быть на два порядка выше. Вследствие этого резко сокращается время эксперимента по регистрации дифракц. отражений, а также снижается количество исследуемого вещества. Ряд мембранных Б. кристаллизуется в условиях нативного липидного окружения с образованием так называемой "двухмерных" кристаллов, представляющих из себя регулярно упакованные молекулы БЕЛКИ в бислойной лииидной мембране. При изучении двухмерных кристаллов используют электронную микроскопию и электронографию.

Во многие случаях хорошие результаты получают, применяя нейтронографию. Нейтроны, имея низкую энергию, в отличие от рентгеновских лучей не разрушают кристаллы БЕЛКИ, в результате чего можно получить полный набор дифракц. данных от одного кристалла. С использованием этого метода удается локализовать в структуре БЕЛКИ отдельные атомы водорода, а также расположение молекул кристаллизац. воды.

В общем случае конформация БЕЛКИ в кристалле может отличаться (обычно весьма незначительно) от конформации в растворе. Поэтому наряду с исследованием кристаллов проводят изучение БЕЛКИ и в его природные среде. Существует набор методов исследования пространств. структуры БЕЛКИ в растворе. наиболее часто используемые - оптический методы (УФ-, ИК- и Раман-спектроскопия, круговой дихроизм, флуоресценция), ЯМР и ЭПР. Ни одним из этих методов в отдельности, как правило, невозможно определить конформацию БЕЛКИ, тогда как их комбинация в ряде случаев дает информацию, которая сравнима по ценности с рентгеноструктурным анализом.

Рис. 5. Расположение молекулы бактериородопсина в пурпурно" мембране. Участки полипептидной цепи, доступные для иодирования лактопероксидазой-L, протеолиза папаином-Р, химотрипсином-Ch и карбоксипептидазой А - СрА. А-антигенные детерминанты.

Оптич. методы позволяют следить за изменениями конформации БЕЛКИ в процессе функционирования или при изменении окружающих условий. Комбинация этих методов дает информацию об относит. содержании в БЕЛКИ элементов вторичной структуры, о расположении остатков триптофана относительно поверхности белковой глобулы и о конфигурации связей С—S—S—С в дисульфидных мостиках.

Прямую информацию о пространств. строении БЕЛКИ в растворе дает метод ЯМР. Совр. методики ЯМР-спектроскопии позволяют проводить практически полное отнесение сигналов в спектрах пептидов и небольших БЕЛКИ (с молекулярная масса до 10.000) к определенным ядрам в молекуле. Использование гомоядерных (1Н—1H) и гетероядерных (*Н—13C) констант спин-спинового взаимодействия дает возможность определять торсионные углы и основные полипептидной цепи и торсионный угол х" боковых цепей аминокислотных остатков. С помощью ядерного эффекта Оверхаузера, сдвиговых и уширяющих реагентов (ионы парамагн. металлов, спиновые метки) измеряют расстояния между отдельными ядрами молекулы. Т. обр. для пептидов и небольших БЕЛКИ удается определить пространств. структуру с разрешением до 0,3-0,4 нм. Несомненное достоинство ЯМР-спектроскопии - возможность получать информацию о динамике пространств. структуры молекулы БЕЛКИ

Модификация БЕЛКИ реагентами, несущими свободный радикал (спиновая метка) или флуоресцентную группировку, позволяет судить о химический окружении модифицируемой группы, а при наличии в БЕЛКИ двух таких меток - измерить расстояние между ними.

Теоретически возможно предсказывать в общем виде пространств. строение Б., исходя из его аминокислотной последовательности. Такого рода расчеты проводят с помощью ЭВМ на основании закономерностей, выведенных в результате статистич. обработки данных для БЕЛКИ с установленной пространств. структурой. В ряде случаев расчетные методы дают удовлетворительные результаты, которые помогают интерпретировать данные, полученные др. методами.

При исследовании пространств. структуры БЕЛКИ часто используют ограниченный протеолиз, проводящийся в мягких неденатурирующих условиях, в которых гидролизуются исключительно пептидные связи, находящиеся на поверхности глобулы БЕЛКИ Таким путем получают информацию о доменной структуре БЕЛКИ В случае мембранных БЕЛКИ этим методом удается различить участки полипептидной цепи, расположенные внутри мембраны и на ее поверхности (рис. 5). Аналогичную по характеру, но значительно более детальную информацию получают при изучении взаимодействие БЕЛКИ и их отдельных фрагментов с антителами.

Синтез. Биосинтез БЕЛКИ происходит в результате трансляции в субклеточных частицах - рибосомах, представляющих собой сложный рибонуклеопротеидный комплекс. Информация о первичной структуре БЕЛКИ "хранится" в соответствующих генах - участках ДНК - в виде последовательности нуклеотидов. В процессе транскрипции эта информация с помощью фермента - ДНК-зависимой РНК-полимеразы - передается на матричную рибонуклеиновую кислоту, которая, соединяясь с рибосомой, служит матрицей для синтеза БЕЛКИ Выходящие из рибосомы синтезированные полипептидные цепи, самопроизвольно сворачиваясь, принимают присущую данному Б. конформацию, а также подвергаются модификации благодаря реакциям различные функциональных групп аминокислотных остатков и расщеплению пептидных связей (см. Модификация белков).

Химическая синтез широко применяют для получения пептидов, в т.ч. биологически активных гормонов и их разнообразных аналогов, используемых для изучения взаимосвязи структуры и биологическое функции, а также пептидов, несущих антигенные детерминанты различные БЕЛКИ и применяемых для приготовления соответствующих вакцин. Первые химический синтезы БЕЛКИ в 60-е гг. (инсулина овцы и рибонуклеазы SX осуществленные в растворе с помощью тех же методов, которые используют при синтезе пептидов, были связаны с чрезвычайно большими сложностями. В каждом случае требовалось провести сотни химический реакций и окончательный выход БЕЛКИ был очень низок (менее 0,1%), в результате чего полученные препараты не удалось очистить. Позже были синтезированы некоторые химически чистые БЕЛКИ, в частности инсулин человека (П. Зибер и др.) и нейротоксин II из ядра среднеазиатской кобры (В. Т. Иванов). Однако до сих пор химический синтез БЕЛКИ представляет весьма сложную проблему и имеет скорее теоретич., чем практическое значение. Более перспективны методы генетической инженерии, которые позволяют наладить пром. получение практически важных Б. и пептидов.

Значение белков в питании. Б.-необходимая составная часть продуктов питания. Проблема пищевого БЕЛКИ стоит очень остро. По данным Международной организации по продовольствию и с. х-ву при ООН больше половины человечества не получает с пищей необходимого кол-ва БЕЛКИ Недостаток БЕЛКИ в пище вызывает тяжелое заболевание - квашиоркор.

В процессе пищеварения БЕЛКИ подвергаются гидролизу до аминокислот, которые и всасываются в кровь. Пищ ценность БЕЛКИ зависит от их аминокислотного состава, содержания в них так называемой незаменимых аминокислот, не синтезирующихся в организмах (для человека незаменимы триптофан, лейцин, изолейцин, валин, треонин, лизин, метионин и фенилаланин). В питательном отношении растит. Б. менее ценны. чем животные; они беднее лизином, метионином и триптофаном, труднее перевариваются. Один из путей решения проблемы - добавление в растит. пищу синтетич. аминокислот. Наряду с этим выводят новые сорта растений, содержащие гены, ответственные за синтез недостающих аминокислот. Перспективно использование для этого методов генетич. инженерии. Чрезвычайно важное значение имеет широкое внедрение пром. микробиологического синтеза, например выращивание дрожжей на гидролизном этиловом спирте, природные газе или нефти. Получаемые при этом белково-витаминные концентраты (БВК) используют в качестве добавок к корму с.-х. животных. Исследования советских микробиологов и технологов (Г. К. Скрябин и др.) послужили основой для производства БВК в СССР в крупных масштабах.

Химическая энциклопедия. Том 1 >> К списку статей


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]    [обратная связь]

 

 

Реклама
плиты перекрытия пк 63
заказать автобус на 30 мест в москве
шкаф картотечный afc-07/5
mst 32-80-16.0-c24-f смесительный узел с гибкими подводками

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(28.07.2017)