енные соединения - гетероциклы, амины, кислоты.

Нормально-фазовый вариант ВЭЖХ применяется в том случае, когда исследуемые соединения подвержены гидролизу в кислых водных средах. Примером может служить анализ неочищенного продукта синтеза серосодержащего диазепина-S. В условиях обращённо-фазовой системы диазепин-S гидролизуется с образованием гидрофильных соединений (рис. 11.2). Условия хроматографирования: колонка 80x2, заполненная Диасорбом С16Т (12% С) или аналогичным по свойствам адсорбентом, элюент «ацетонитрил-универсальный буфер» в объёмном отношении 30:70. Детекция: 210,220, 254 и 278 нм.

по

тйа12.В01 18.82.2081 14:24:08

F1IT2

F5 F1B

PGUP PGDN + fJ BS CAPS

Рис. 11.2. Хроматограмма неочищенного продукта синтеза соединения диазепин-S, обращённо-фазовый вариант: 1,2,3 - пик продуктов гидролиза, 4 - бенздиазепнн-S. Остальные пики соответствуют примесям

В этом случае анализ должен проводиться на нормальной фазе. На рисунке 11.3 приведены хроматограммы продукта синтеза соединения бенздиазепин-S на силикагеле и нитрильной (CN) фазе. Условия хроматографирования: колонки 80x2, элюент «гексан-хлороформ-изопропанол» 76:20:4, детектирование на длинах волн 232, 254, 270 нм. Из приведённых хроматограмм видно, что в данном случае

IN

нитрильная фаза проявляет по сравнению с силикагелем уникальную селективность по отношению к анализируемым соединениям.

а

И

ОПОРНАЯ

0.800 ? .600

О.4О0

0.2Q0О.ООО

т

1.1Q4

\

\ ^

4

J < VJ v. J\ V

Л—f

0.800 О.ТОО О.бОО О .500 0.400 -О.ЗОО -0.200 0.1О0

О.ООО.039

о.ооо г.ооо 4.ооо 6. ооо starts.801 11.03.2861 14*48:58

1 1 1 . 1 . Р

в. ООО Ю.ООО 12.ООО 14.ООО

и

Опорная

. Р(.Ш' PGDN п- RS

Рис. 11.3. Хроматограмма неочищенного продукта синтеза соединения бенздиазепнн-S, нормально-фазовый вариант: а - на силикагеле; б - на аминопропилированном силикагеле

12. ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВЭЖХ ДЛЯ АНАЛИЗА РАЗЛИЧНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В БИООБЪЕКТАХ

Использование ВЭЖХ для анализа различных соединений в биообъектах подробно рассмотрено в работах [1,2]. Наша задача -показать возможности универсального элюента и микроколоночных хроматографов серии "Милихром" для анализа различных соединений в биообъектах при их грамотном использовании.

12.1 Определение альдегидов и кетонов в плазме крови методом ОФ ВЭЖХ в виде производных 2,4-динитрофенил-идразона (ДНФГ)

Скрининг альдегидов и кетонов в биообъектах осуществляется с целью определения карбонилсодержащих соединений - отходов производства промышленных предприятий - в организме человека.

12.1.1 Подготовка пробы

К 2 мл плазмы крови прибавляют 2 мл 0.2% спиртового раствора ДНФГ и 0.2 мл концентрированной соляной кислоты; реакционную смесь оставляют на 30 минут, затем разбавляют 20 мл воды и экстрагируют трижды 5 мл гексана. Объединённый гексановый экстракт упаривают на роторном испарителе, остаток растворяют в 0.5 мл ацетонитрила.

12.1.2 Хроматографический анализ

Для хроматографического анализа применяются колонка 80x2, заполненная Диасорбом С16Т или аналогичным по свойствам адсорбентом, реактивы: вода дистиллированная, ацетонитрил для хроматографии «Криохром» 0-го, 1-го или 2-го сорта (г. Санкт-Петербург).

Режим работы хроматографа: длина волны - 358 нм, скорость подачи - 150 мкл/мин., объем вводимой в колонку пробы - 3-5 мкл; элюент «ацетонитрил-вода-диэтиламин-уксусная кислота» в соотношении 50:50:1:1.5 по объему (рис. 12.1). При использовании стандартного элюента «ацетонитрил-вода» хроматографические пики

из

OJSOO

о.*оо

ОЛОО

О .ООО

уширяются, и эффективность хроматографической колонки падает в 5 (!) раз (рис. 12.2).

Рис. 12.1. Хроматограмма ДНФГ производных карбон ил содержащих соединений: 1 - ДНФГ, 2 - формальдегид; 3 - ацетальдегид; 4 - ацетон; 5 - пропаналь; 6 - изомасляный альдегид. Колонка 80x2 заполнена

Диасорбом С16 (12% углерода)

12.2 Определение кортикостероидных гормонов:

альдостерона, кортизона, кортизола и тестостерона

Известно несколько вариантов определения кортикостероидных гормонов в плазме крови [2].

Нами опробован и немного изменен [3] обращенно-фазовый вариант определения альдостерона, кортизона, кортизола и тестостерона на хроматографах серии «Милихром».

12.2.1 Подготовка пробы

В стеклянные пробирки объемом 15 мл помещают 0.5 мл плазмы, 0.5 мл бидистиллированной воды и 4 мл гексана, встряхивают в течение трех минут и органический слой отсасывают на водоструйном насосе. После этого проводят экстракцию гормонов, добавляя 9 мл хлороформа к оставшейся в пробирке водной фазе и встряхивают смесь в течение пяти минут. Водный слой отсасывают, а органический - последовательно переносят в пробирку объемом 1 мл и упаривают в токе азота при температуре 40°С. Остаток растворяют в 24 мкл элюента. 10 мкл экстракта вносят в хроматограф. Предел обнаружения- 4 нг/мл (рис. 12.3).

1. Еремин С.К., Изотов Б.Н. Анализ наркотических средств.- М. Мысль, 1993.-281 с.<