оцедуры заключается в эффекте «высаливания» органических соединений на границу раздела «адсорбент - элюент» и увеличении межфазного поверхностного натяжения «элюент - адсорбат», что, в свою очередь, приводит к увеличению энергии взаимодействия «адсорбат -адсорбент». В сочетании с регулировкой рН для смещения равновесия «диссоциированная форма - молекулярная форма» (молекулярная форма в обращенно-фазовом варианте удерживается всегда сильнее, чем диссоциированная) высаливание позволяет резко увеличить удерживаемые объемы полярных соединений;

3) замена самоассоциата "адсорбат - адсорбат" на поверхности адсорбента на ассоциат "адсорбат - компонент элюента" достигается путем использования смешанных модификаторов типа "ацетонитрил -алифатический спирт" или добавлением в элюент небольших количеств органических кислот или алифатических аминов. Например, при анализе терпенов на поверхности адсорбента лучше иметь ассоциат "терпен - метанол", который дает меньшее уширение пика, чем "терпен - терпен". При одновременном анализе смесей веществ слабокислого и слабоосновного характера одновременно добавляют в элюент уксусную кислоту и алифатический амин при общем рН< 7, чтобы избежать самоассоциации анализируемых веществ любого характера на поверхности адсорбента. Наиболее универсальным элюентом в ОФ ВЭЖХ является смесь "ацетонитрил0.03 М КН2Р04-диэтиламин-фосфорная кислота". Раствор диэтиламина в 0.03 М КН2Р04 подкисляется фосфорной кислотой до рН=2.6 - 3.0. Такой универсальный элюент особенно эффективен при анализе водных, водно-спиртовых или спиртовых растительных или животных экстрактов, содержащих ионогенные соединения как

кислого, так и основного характера.

Подкисление до рН=2.6-3.0 гарантирует, что все ионогенные соединения кислого характера находятся в молекулярной форме, а слабоосновные существуют в виде ионизированных соединений и сдвинуты в начало хроматограммы.

Например, при разделении стандартов опиумных алкалоидов, барбитуратов и бенздиазепинов для получения симметричных пиков достаточно использовать 0,05М водный раствор КН2Р04 (рис. 4Л0).

1 =

О 5 10 15 20 25 30

t, МИН.

Рис. 4.10. Хроматограмма сильнодействующих лекарственных препаратов: 1 - морфин, 2 - кодеин, 3 - барбитал, 4 - фенобарбитал, 5 - промедол, 6,7 - примеси, 8 - этаминал, 9 - нозепам, 10 - радедорм, 11 - элениум. Колонка 80x2 заполнена Силасорбом SPH С18. Элюент «ацетонитрил-водный раствор 0,05М КН2РО4», расход 100 мкл/мин. Длина волны 218 нм

Добавление однозамещенного фосфата калия преследовало две цели:

1) слабое подкисление элюента со стабилизацией рН;

2) увеличение удерживаемых объемов хорошо растворимых в

воде веществ за счет увеличения межфазного поверхностного

натяжения "адсорбат - водно-солевой элюент".

ft

Увеличение удерживаемых объемов анализируемых веществ путем уменьшения содержания ацетонитрила в элюенте при его низком содержании в элюенте может привести к большим отклонениям удерживаемых объемов при воспроизведении методики. Тонкую регулировку удерживания в данном случае выполняет однозамещенный фосфат калия. Чем больше концентрация соли, тем больше удерживаемые объемы ионогенных соединений. Однако при больших (порядка 0.1М) концентрациях соли крайне высока опасность кристаллизации солей в хроматографической колонке или узлах хроматографа; поэтому поднимать концентрацию солей более 0.05 М не рекомендуется, тем более, что при дальнейшем увеличении концентрации соли в элюенте удерживаемые объемы изменяются незначительно.

При усложнении анализируемой смеси (например, при анализе опия) приходится использовать значительно более сложный элюент: ацетонитрил-фосфатный буфер, подкисленный фосфорной кислотой до рН=2.6 и содержащий 0,02М раствор диэтиламина (рис. 4.11).

Ш ол. ]

Правило 4. "ТОНКАЯ РЕГУЛИРОВКА рН"

0.990

0.8000.600

Подкисление элюентов при анализе сложных смесей веществ (как правило, растительных экстрактов) является действенным регулятором селективности. Растительные экстракты обычно содержат вещества как основного, так и кислотного характера. Подкисление приводит к увеличению удерживаемых объемов соединений, имеющих кислый характер, и уменьшению удерживаемых объемов соединений, имеющих основной характер. Регулируя рН в области 2.5 - 5, мы можем добиться хорошего разделения весьма сложных смесей без дополнительных затрат (рис. 4.12).

Рис. 4.12. Хроматограмма водного экстракта травы зверобой. Колонка 120x2 заполнена Диасорбом С16. Элюент «ацетонитрил-0.03 М однозаметенныйфосфат калия-ДЭА» (18:71:1); раствор ДЭА в 0.03 М КН2Р04 подкислен фосфорной кислотой до рН=2.8. Расход 100 м к л/мин.

Длины волн 230 и 254 нм

Правило 5. "ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРОТИВОИОНОВ" При анализе полярных соединений в ОФ ВЭЖХ встает проблема увеличения времен удерживания для улучшения разделения компонентов смеси. В том случае, если резервы увеличения удерживаемых объемов за счет уменьшения содержания модификатора в элюенте исчерпаны, а удовлетворяющий Вас эффект не достигнут, увеличение времен удерживания дост