оверхности молекулы. Молекула свернута очень сложно; в отличие от миоглобина и гемоглобина она содержит очень мало а-спира-лей. Полипептидные цепи в основном вытянуты и нередко идут параллельными тяжами на расстоянии друг от друга примерно 5 А. Между пептидными группами в прилегающих тяжах образуются многочисленные водородные связи. Часть молекулы обладает вторичной структурой, напоминающей антипараллельные складчатые слои, как это наблюдалось и в лизоциме.

8.3. Химотрипсин специфичен в отношении

ароматических и больших неполярных боковых цепей

Биологическая роль химотрипсина -гидро-лизовать белки в тонком кишечнике (рис. 8.6). Равновесие этой реакции сдвинуто почти полностью в сторону гидролиза (> 99%). Однако химотрипсин способен ги-дролизовать с высокой скоростью далеко не всякую пептидную связь. Он действует избирательно на пептидные связи, образованные карбоксильными группами аминокислот с ароматическими боковыми цепями-тирозина, триптофана и фенилаланина, а также аминокислот с гидрофобными остатками большого размера, например метионина (рис. 8.7).

Химотрипсин гидролизует также эфирные связи. Хотя эта реакция не имеет существенного физиологического значения, она представляет интерес в том отношении, что имеет много общего с гидролизом пептидной связи (рис. 8.6). По существу, значительная часть сведений о механизме каталитического действия химотрипсина была получена при изучении гидролиза простых эфиров.

8.4. При катализе химотрипсином часть субстрата ковалентно связывается с ферментом

Химотрипсин катализирует гидролиз пептидных и эфирных связей в два отдельных

Рис. 8.5. Трехмерная структура а-химо-трипсина. Показаны только ос-углеродные атомы. Цветом отмечены участвующие в катализе остатки. (Blow D.М. In: The Enzymes, P.D. Boyer, ed., 3rd ed., v. 3, Acad. Press, 1971, p. 194)

этапа. Впервые это было обнаружено при

изучении кинетики гидролиза

и-нитрифенилацетата. При использовании больших количеств фермента можно отчетливо проследить наличие двух фаз в высвобождении одного из продуктов реакции -и-нитрофенола (рис. 8.8). Сначала наблюдается быстрое взрывообразное высвобождение и-нитрофенола, после чего он образуется уже с меньшей стационарной скоростью.

На первом этапе л-нитрофенилацетат присоединяется к химотрипсину, т.е. образуется фермент-субстратный (ES) комплекс

О

II

Rj—С N—R2 + Н20

Н

Пептид

О

II

Rj—С О—R2 + Н20 Эфир

Рис. 8.6. Химотрипсин катализирует гидролиз пептидных и эфирных связей.

(рис. 8.9). Эфирная связь в субстрате при этом расщепляется. Один из продуктов реакции - п-нитрофенол - высвобождается, тогда как ацетильная группа субстрата становится ковалентно связанной с ферментом. Далее вода атакует ацетил-ферментный комплекс с образованием ацетат-иона и регенерированного фермента (рис. 8.10). Начальная быстрая фаза высвобождения и-нитрофенола соответствует этапу образования ацетил-ферментного комплекса. Этот этап называется ацилированием. Более медленное стационарное образование и-нитрофенола соответствует этапу гидролиза ацетил-ферментного комплекса и регенерации свободного фермента. Этот второй этап, называемый деацилированием, лимитирует скорость всего процесса гидролиза эфиров химотрипсином. Более того, ацетил-ферментный комплекс настолько стабилен, что при благоприятных условиях его удается выделить. Механизм катализа химотрипсиRt—Сч + Н N—R2

оКислота Амии

R,—С + НО—R, + Н+

V

Кислота Спирт> Е

ES

т

ном можно представить в виде следующей схемы:

Е + S ^

где Pj-аминный {или спиртовой) компонент субстрата, Е-Р2- промежуточный продукт, образованный в результате кова-лентного связывания, Р2- кислотный компонент субстрата.

Особенность этого механизма реакции состоит в образовании промежуточного продукта путем ковалентного связывания; в рассмотренном выше случае происходило ковалентное соединение ацетильной группы с ферментом. В общем случае группа, присоединенная к химотрипсину на стадии Е-Р2,-это всегда ацильная группа. Таким образом, Е2 Р представляет собой промежуточное соединение ацил - фермент.

8.5. Ацильная группа соединяется с необычайно реакционноспособным остатком серина на ферменте

Место, в котором происходит присоединеR

!

сн,

ОН» |Фермент1

После смешивания химотрипсина и и-нитрофенилацетата можно наблюдать две фазы образования п-нитрофенола.

О

Фермент! + С—СН,

с—сн.

N0,

N02

п-Н и трофеи ил ацетат

Промежуточный л-Нитро-продукт ацетил— фенол фермент

Рис. 8.9. Ацилирование: образование комплекса ацетил - фермент в качестве промежуточного продукта.

R

I

СН2

он

Тирозин

R

I

СН2

I

сн2

1

S

I

сн3

Фермент

Фермент

+ н2о

I

с—сн,

Ацетат

Промежуточный продукт ацетил — фермент

Рис. 8.10. Деацилирование: гидролиз промежуточно образующегося комплекса ацетил - фермент.

Рис. 8.7.

Триптофан Метионин

Химотрипсин гидролизует предпочтительно пептидные связи, образованные карбоксильными группами ароматических аминокислот, а также аминокислот с больш