е карбоксипепти-дазы А. В результате связавшийся на ферменте субстрат оказывается со всех сторон окруженным каталитическими группами. Это обеспечивает возможность катализа по причинам, о которых говорилось выше. Совершенно очевидно, что только гибкость структуры фермента обеспечивает попадание субстрата в сферу действия системы каталитических групп (и выход продуктов реакции из этой системы). В целом гибкая структура фермента имеет преимущество перед жесткой в том отношении, что она обладает гораздо большим выбором возможных конформации, пригодных для катализа и сохраняющихся в процессе отбора. Кроме того, индуцированное соответствие вносит вклад в повышение специфичности фермента. В самом деле, в случае карбоксипептидазы А субстрат должен иметь концевой карбоксилат-ион; фермент «проверяет» его наличие таким путем: если концевой карбоксилат-ион имеется, то он образует солевую связь с аргинином-145, а это вызывает перемещение тирозина-248 в каталитически активное положение; если же концевого карбоксилат-иона нет, то ти-розин-248 остается на месте и фермент не проявляет активности. Другими словами, индукция соответствия может функционировать как динамический процесс узнавания.

СН2

I

N—Н

о=?с но 1

н+

%'?

с

J

GIL.-2 7Q

Рис. 7.29. Второй возможный механизм каталитического действия карбоксипептидазы А. Туг 248 выполняет ту же функцию, что и на рис. 7.28. В остальном процесс протекает иначе: Glu 270 активирует молекулу воды, которая атакует карбонильный атом углерода расщепляемой пептидной связи. Гидролиз осуществляется прямо, без промежуточного образования ангидрида.

Заключение

Лизоцим-фермент относительно небольшого размера, расщепляющий полисаха-ридный компонент клеточных стенок бактерий. По своей структуре указанный полисахарид представляет собой чередующийся полимер остатков N-ацетилглюкозамина (NAG) и N-ацетилмурамовой кислоты

(NAM), соединенных гликозидными связями р (1 -»• 4). Лизоцим гидролизует глизозид-ную связь между С-1 остатка NAM и С-4 остатка NAG. Олигомеры N-ацетилглюко-замина также гидролизуются лизоцимом. При этом гекса-NAG и более длинные полимеры легко расщепляются ферментом, тогда как три-NAG и ди-NAG гидролизуются с крайне малой скоростью. Три-NAG— сильный конкурентный ингибитор фермента. Трехмерная структура лизоцима и его комплекса с три-NAG изучена на атомарном уровне. Установлено, что три-NAG занимает половину щели, идущей поперек молекулы фермента, с которым он связывается большим количеством водородных связей и вандсрваальсовых взаимодействий. На основе данных о структуре комплекса лизоцима с три-NAG была построена модель, предсказывающая, как связывается с лизоцимом ею эффективный субстрат гекса-NAG.

Предложена гипотеза механизма каталитического действия лизоцима; суть гипотезы состоит в следующем. Первое; критическими группами для катализа являются неионизированная карбоксильная группа остатка глутамата-35 и карбоксилат-ион аспартата-52. Обе группы расположены на расстоянии около 3 А от гидролизуемой гликозидной связи, а именно связи между остатками D и Е гексамерного субстрата. Второе: глутамат-35 отдает Н+ связи между С-1 кольца D и гликозидным атомом кислорода, что приводит к разрыву этой связи. С-1 кольца D становится положительно заряженным; такая переходная форма называется ионом карбония. Третье: ион карбония реагирует с ОН ~ -группой растворителя, а глутамат-35 присоединяет водород, возвращаясь в исходную протонированную форму. После того как продукты реакции удаляются от фермента в результате диффузии, лизоцим готов к новому каталитическому циклу. Четвертое: скорость катализа значительно увеличивается под действием двух факторов, способствующих промежуточному образованию иона карбония: это электростатический фактор, а именно близость отрицательно заряженной боковой цени аспартата-52 и геометрический фактор, состоящий в том, что кольцо D деформируется, приобретая конформацию полукресла, что приводит к распределению положительного заряда иона карбония между С-1 и атомом кислорода углеводного кольца.

Карбоксипептидаза А, пищеварительный фермент, расщепляющий С-концевой пептид в полипептидах, служит примером фермента, в основе каталитического действия которого лежит совершенно иной механизм. Структура этого фермента и его комплекса с глицилтирозином - аналогом субстрата-раскрыта на уровне атомного разрешения. Связывание глицилтирозина вызывает большие структурные изменения в области активного центра, в результате которых эта область теряет воду и становится гидрофобной. Пример карбоксипептидазы А иллюстрирует ту важную роль, которую играет в катализе индуцированное соответствие формы фермента форме субстрата. Другая примечательная особенность данного фермента состоит в том, что в его активном центре содержится ион цинка, имеющий существенное значение для катализа. Карбонильный атом углерода расщепляемой пептидной связи поляризуется цинком и становится более чувствительным к нуклеофиль-ной атаке. Здесь мы видим пример индукции смещения элект