вступает в электростатическое взаимодействие с положительно заряженной боковой цепью аргинина-145.

2. Субстрат через боковую цепь своего тирозина связывается в неполярном кармане фермента.

3. Водород NH-группы той пептидной

Рис. 7.26.

Пространственное расположение глицилтирозина в активном центре карбоксипептидазы А. Глицилтирозин (субстрат) изображен красным. (BlowD.M., SteitzT.A., X-ray diffraction studies of enzymes, Ann. Rev. Biochem., 39, 78, Copyright 1970.) связи, которая должна гидролизоваться, соединяется водородной связью с ОН-груп-пой ароматической боковой цепи тиро-зина-248.

4. Карбонильный кислород той же пептидной связи вступает в координационную связь с ионом цинка.

5. Концевая аминогруппа субстрата образует водородную связь через вклинивающуюся молекулу воды с боковой цепью глутамата-270. Это взаимодействие, вероятно, не имеет места в случае реакционноспо20 А

6

Рис. 7.27. Структура карбоксипептидазы А меняется при связывании субстрата: А -фермент без субстрата (Arg 145 показан желтым, Glu 270-зеленым, Туг 248-синим); Б-фермент-субстратный комплекс (глицилтирозин, субстрат, изображен красным). На рисунке показана только часть молекулы фермента. [Lipscomb W, N, Proc. Robert A. Welch Found. Conf. Chem. Res., 15, 140-141 (1971).]

у

Tyr-248

собного ES-комплекса, и именно оно, возможно, является причиной крайне медленного гидролиза глицилтирозина.

Связывание глицилтирозина сопровождается структурной перестройкой активного центра (рис. 7.27). В сущности, только присоединив субстрат, каталитические группы фермента принимают правильную ориентацию-положение, впервые постулированное Кошландом (Koshland) в его модели индуцированного соответствия. Гуанидиниевая группа аргинина-145, а также карбоксильная группа глутамата-270 перемещаются на 2 А. Связывание карбонильной группы субстрата с ионом цинка вытесняет из связи с цинком молекулу воды. По крайней мере еще четыре молекулы воды вытесняются из неполярного кармана на ферменте при связывании с ними тирозиновой боковой цепи в молекуле субстрата. Самое большое изменение конформации - это перемещение фе-нольного гидроксила тирозина-248 на 12 А, т. е. на расстояние, составляющее около 1 /4 диаметра молекулы. Такое перемещение осуществляется в первую очередь, путем свободного вращения относительно одинарной связи —С—С— и состоит в том, что гидроксильная группа тирозина-248, бывшая на поверхности молекулы, перемещается, оказываясь вблизи пептидной связи субстрата. В результате закрывается полость активного центра и тем самым завершается превращение ее из области, заполненной водой, в гидрофобную. Все эти структурные изменения инициируются, по-видимому, связыванием аргинина-145 с концевой карбоксильной группой субстрата.

7.10. Скорость катализа карбоксипептида-зой А возрастает благодаря смещению электронов

На основе данных рентгеноструктурного анализа Липском (Lipscomb) предложил механизм каталитического действия карбокси-пептидазы А. Постулированная структура реакционноспособного ES-комплекса показана на рис. 7.28. Согласно предложенному механизму, ОН-группа тирозина-248 отдает протон на NH-группу расщепляемой пептидной связи. Карбонильный атом углерода этой пептидной связи подвергается атаке со стороны карбоксильной группы глутамата-270, которая выступает в данном случае как нуклеофильная группа. Образующийся в результате ангидрид глутамата-270 и кислотного компонента субстрата подвергается далее гидролизу.

Возможен и другой механизм катализа, также согласующийся с данными рентгеноструктурного анализа; он показан на рис. 7.29. По этой схеме глутамат-270 активирует молекулу воды. Образующийся ОН" непосредственно атакует карбонильный атом углерода расщепляемой пептидной связи. Одновременно тирозин-248 отдает протон на ее NH-группу, и в итоге пептидная связь гидролизуется. Этот механизм катализа отличается от механизма, приведенного на рис. 7.28, тем, что предполагает гидролиз водой непосредственно пептидной связи субстрата, а не промежу

точно образующегося ангидрида. Проведенные в последнее время химические и спектроскопические исследования свидетельствуют о том, что гидролиз пептидных субстратов осуществляется по прямому механизму, тогда как гидролиз эфиров протекает через промежуточное образование ангидрида с глутаматом-270.

Какова роль цинка в этих схемах катализа? Карбонильная группа расщепляемой пептидной связи обращена к иону цинка таким образом, что связь С—О оказывается более поляризованной, чем обычно; это делает карбонильный атом углерода более чувствительным к нуклеофильной атаке. Неполярное окружение иона цинка увеличивает его эффективный заряд и тем самым его способность индуцировать диполь. Сильной поляризации карбонильной группы способствует также близость отрицательного заряда глутамата-270. Следовательно, карбокиспептидаза А индуцирует такое смещение электронов на субстрате, которое повышает скорость катализа.

Теперь мы можем оценить значение индуцированных субстратом структурных изменений в активном центр