ение kt не может быть выше 108-109 М-1с-1. Отсюда следует, что верхний предел отношения к3/К^ составляет 108-109 М_1с-1. Это ограничение сохраняет свою силу

Таблица 6.2. Максимальное число оборотов некоторых ферментов

Н

I

н,с—С—СН,

I

о

IСН2 — О— Р=0 + HF

о

HjC—с—сн3 н

основным механизмом контроля. Подавление ферментативной активности лежит также в основе действия многих лекарственных веществ и токсических агентов. Наконец, анализ ингибирования ферментов является одним из подходов к изучению механизмов ферментативного действия. Ингибирование ферментов может быть как обратимым, так и необратимым. При Необратимом ингиби-ровании ингибитор ковалентно соединяется с ферментом или же связывается так прочно, что диссоциация идет очень медленно. Пример необратимого ингибирования— действие нервнопаралитических ядов на ацетилхолинэстеразу, играющую важную роль в передаче нервных импульсов. Одно из таких отравляющих веществ-диизопро-пилфторфосфат - взаимодействует с имеющим критическое значение остатком серина в активном центре фермента с образованием неактивного комплекса диизопропил-фосфорил — фермент (рис. 6.14). Ал к ил и-рующие агенты, например иодоацетамид, способны к необратимому ингибированию ферментов путем модификации цистеина и других боковых цепей (рис. 6.15).

В отличие от рассмотренной ситуации при обратимом ингибировании равновесие между ингибитором и ферментом устанав

сооI

сн,

I

соо

ливается быстро. Простейший вид обратимого ингибирования-это конкурентное ингибирование. Конкурентный ингибитор похож на субстрат и потому связывается активным центром фермента (рис. 6.16). Это препятствует связыванию субстрата в том же активном центре. Иными словами, невозможно одновременное связывание субстрата и конкурентного ингибитора. Конкурентный ингибитор уменьшает скорость катализа путем снижения доли молекул фермента, связавших субстрат. Классический пример конкурентного ингибирования-действие малоната на сукцинат-дегид-рогеназу-фермент, отщепляющий от сук-цината ионы водорода. Малонат отличается от сукцината тем, что имеет не две ме-тильные группы, а одну:

сооI

СН2

I

сн,

сооСукцинат Малонат

Физиологически важный пример конкурентного ингибирования связан с образованием 2,3-бисфосфоглицерата из 1,3-бисфос-фоглицерата. Фермент, катализирующий эту изомеризацию,- бисфосфоглицератму-таза-конкурентно ингибируется низкими концентрациями 2,3-бисфосфоглицерата.

О

(Фермент)— CH2SH + ICH2—С — NH,> (фермент)—СН- S СН2—С—NH2 + HI

Иодацетамид

Рис. 6.15. Инактивация иодоацетатом фермента, для активации которого остаток цистеина имеет критическое значение.

Конкурентный ингибитор

В сущности, это довольно обычное явление, когда продукт ферментативной реакции ведет себя как конкурентный ингибитор в силу структурного сходства с субстратом.

При неконкурентном, но тоже обратимом ингибировании ингибитор и субстрат могут связываться молекулой фермента одновременно; само по себе это показывает, что участки их связывания не перекрываются. Действие неконкурентного ингибитора заключается в уменьшении числа оборотов фермента, а не в снижении доли связавших субстрат молекул фермента. Возможны и более сложные механизмы ингибирова-ния, когда ингибитор влияет и на связывание субстрата, и на число оборотов фермента.

Активность фермента может быть инги-бирована также в результате взаимодействия между разными субъединицами оли-гомерного фермента. Этот тип ингибирова-ния, называемый аллостерическим ингиби-рованием, имеет очень важное значение для физиологических процессов. Мы его рассмотрим несколько ниже.

С—о-Н—С—ОРО,2I 3

Н2С— ОР0322,3- бисфосфогли цврат

6.14. Конкурентное и неконкурентное инги-бирование различаются по кинетике

1

(24)

Измерение скоростей катализа при разных концентрациях субстрата дает возможность отличить конкурентное ингибирование от неконкурентного. При конкурентном ингибировании на графике, где 1/Котложена против 1/[S], прямая пересекает ось ординат в одной и той же точке независимо от присутствия ингибитора; меняется только угол наклона прямой (рис. 6.17). Это показывает, что при конкурентном ингибировании VmAX не изменяется. Особенность конкурентного ингибирования состоит в том, что при достаточно высокой концентрации субстрата ингибирование может быть преодолено. В самом деле, субстрат и ингибитор конкурируют за один и тот же участок. При достаточно высокой концентрации субстрата почти все активные центры заняты субстратом и фермент проявляет полную активность. Увеличение утла наклона прямой на графике зависимости I/VOT 1/[S] указывает на прочность связи конкурентного ингибитора. В присутствии конкурентного ингибитора уравнение (16) заменяется следующим:

где [I]-концентрация ингибитора, а К;-константа диссоциации комплекса фермент -ингибитор

Е + 1^Е1, И [I]

(25)

[EI]

Другими словами, в присутствии конкурентного ингибитора наклон прямой увеличивается на величину (\ + -^-\ Рассмотрим

К;

фермент с Хм, равной 10 4 М. В отсутствие ингибит