отражает число оборотов фермента, если известна концентрация активных центров (Ег), так как

6.11. Значение величин Км и К

Каях — ^3 [Ет] •

(20)

Км для разных ферментов варьирует в широком диапазоне величин (табл. 6.1). Для большинства ферментов величина Км лежите пределах 10"1 — 10" 6 М. Значение Км фермента зависит от природы субстрата, а также от условий среды: температуры, ионной силы. Константа Михаэлиса Км имеет два смысловых значения. Во-первых, Хм-это концентрация субстрата, при которой занята половина активных центров фермента. Если известна Км, то можно рассчитать, какова доля занятых активных центров ДЛЯ любой концентрации субстрата:

(17)

/ES =

[S]

[S] + КМ'

(18)

Во-вторых, Км связана с константами скоростей отдельных этапов катализа, представленных в уравнении (1). Согласно уравнению (7), Км равна (к2 + к3)/к1. Рассмотрим крайний случай, когда к2 намного выше к3, т.е. диссоциация комплекса ES на Е и S происходит гораздо быстрее, чем образование Е плюс продукта реакции. В этих условиях (к2 » к3)

Км= — •

комплекса ES

Константа диссоциации описывается уравнением

^2

(19)

KES=

И [S] [ES]

Другими словами, если к3 намного меньше, чем к2, то Км равна константе диссоциации ES-комплекса. При указанном условии Км служит мерой прочности ES-комплекса: высокая Км-показатель слабого связывания субстрата; низкая Км-показатель сильного

Например, при полном насыщении субстратом растворенная карбоангидраза в концентрации 10"6 М катализирует образование 0,6 М Н2СОэ в секунду. Отсюда к3 = = 6-Ю-5 с-1. Кинетическая константа fc3 называется числом оборотов. Число оборотов фермента-это то количество молекул субстрата, которое превращается в продукт реакции в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом. Число оборотов 6-105 с"1, характерное для карбоангид-разы,-самое большое из всех известных. Каждый новый каталитический акт происходит через промежуток времени, равный l/fe3, что для карбоангидразы составляет 1,7 мкс. Число оборотов большинства ферментов при использовании физиологических субстратов находится в пределах 10* в секунду (табл. 6.2).

6.12. О степени совершенства кинетики ферментативного катализа судят по критерию fcKax/^M

Когда концентрация субстрата намного превышает Км, скорость катализа численно равна /сэ, т. е. числу оборотов, как это описано в предыдущем разделе. Однако в физиологических условиях концентрации субстратов в большинстве случаев ниже насыщающих. Отношение [S]/KM обычно колеблется от 0,1 до 1,0. Если [S] « Км, то скорость ферментативной реакции значительно ниже к}, поскольку большинство активных центров остается свободным. Существуют ли такие параметры, с помощью которых можно описать кинетику ферментативных реакций в этих условиях? Такие параметры имеются и их можно получить, объединив уравнения (2) и (8):

V —

(21)

/с3

[E][S].

V =

(22)

А. Км

Если [S] « Км, то концентрация свободного фермента (Е) практически равна общей концентрации фермента [Ег], и тогда

И [ЕТ].

Таким образом, при [S] « Км скорость ферментативной реакции зависит от величины к3/Км и от [S].

(23)

В каких границах лежит отношение к3/Км1 Обратите внимание, что оно зависит от kit k2 и k3, как можно это показать путем замещения Кы:

^3 ^3^1

Км к2 + к2 и применительно к ферментам, имеющим более сложный механизм реакции, чем тот, что описан в уравнении (1). В случае таких ферментов максимальная скорость катализа при насыщающих концентрациях субстрата, обозначаемая ккат, зависит не от одной к3, а от нескольких констант скоростей. Параметром, характеризующим эти ферменты, является кКат/-^М" Для ряда ферментов, в частности для ацетилхолинэсте-разы, карбоангидразы и триозофосфатизо-меразы, отношение ккот/Км колеблется от 108 до 109М~1с~1. что свидетельствует о достижении ими практически совершенной кинетики: скорость катализируемых ими реакций ограничивается только частотой столкновения фермента с субстратом. Дальнейшее повышение скорости реакции возможно только на основе уменьшения времени диффузии. В действительности часто бывает так, что ферменты, обеспечивающие отдельные метаболические последовательности, организованы в сложные комплексы (разд. 13.10), благодаря чему продукт реакции, катализируемой одним ферментом, быстро попадает на следующий фермент. Таким образом, ограничения, накладываемые скоростью диффузии в растворе, частично снимаются тем обстоятельством, что субстраты и продукты оказываются в малом объеме на полиферментном комплексе.

6.13. Ферменты могут ингибироваться специфическими молекулами

Ингибирование ферментативной активности небольшими специфическими молекулами и ионами имеет очень важное значение, поскольку в биологических системах служит

Предел, которого может достичь отношение k$/KM, определяется значением kt, т.е. скоростью образования комплекса ES. Эта скорость не может превышать число столкновений фермента с субстратом, контролируемое скоростью диффузии. Из-за этого накладываемого диффузией ограничения знач