ной концентрации фермента и малых значениях [S] V почти прямо пропорциональна [S]. При высоких значениях [S] Кпочти не зависит от [S]. В 1913 г. Леонор Михаэлис и Мод Ментен (L. Michaelis, М. Menten) предложили простую модель, объясняющую такую кинетику. Основная их посылка состояла в том, что образование специфического фермент-субстратного комплекса является необходимым промежуточным этапом катализа. Предложенная ими модель, которая простейшим образом описывает кинетические свойства многих ферментов, состоит в следующем: циировать на Е и S с константой скорости к2, либо подвергаться дальнейшему превращению, образуя продукт Р, с константой скорости к3. Постулируется, что продукт реакции Р не превращается в исходный субстрат S; это условие соблюдается на начальной стадии реакции, пока концентрация продукта не достигает ощутимого количества.

Как связана скорость катализа с концентрацией субстрата и фермента и скоростями отдельных этапов реакции? Начнем с того, что скорость ферментативной реакции равна произведению концентрации комплекса ES на константу fc3:

F = fc3[ES]. (2)

Выразим [ES] через известные величины. Скорости образования и распада ES составляют :

Скорость образования ES = [Е] [S]. (3) Скорость распада ES = (fc2 + fc3) [ES]. (4)

Определим скорость катализа в стационарных условиях. Стационарные условия характеризуются тем, что концентрация промежуточных продуктов остается постоянной, тогда как концентрации исходных и конечных продуктов меняются. Это имеет место в том случае, когда скорость синтеза ES-комплекса оказывается равной скорости его распада. Если левые части равенств (3) и (4) равны между собой, то равны и правые, т. е.

(5)

*i [E][S] = (fc2 + /c3)[ES]. Преобразуем это уравнение:

(6)

[Е] [S]

[ES] =

(*2 + *э)/*1

Уравнение (6) можно упростить, если ввести новую константу Км, называемую константой Михаэлиса:

(7)

E + S <=? ES-+ Е + Р.

(1)

кг

Фермент Е соединяется с субстратом S, образуя ES-комплекс; константа скорости этого процесса - к1. Судьба ES-комплекса складывается двояко: он может либо диссоВведем Км в уравнение (6): [Е] [S]

К

м

[ES] =

(8)

1/V

Наклон = Км J Vn

Отрезок, отсекаемый на оси х, - -Л /Км

Отрезок, отсекаемый

на оси у, = i/l/m,!X

Рис. 6.13. Изображение кинетики ферментативной реакции на графике двойных обратных величин: 1/К выражена как функция 1/[S]. Наклон кривой равен точка пересечения с осью у соответствует

1/Tmax, точка пересечения

с осью х — 1/Км.

Рассмотрим числитель в последнем выражении. Концентрация несвязанного субстрата [S] практически равна общей концентрации субстрата при условии, что концентрация фермента значительно ниже концентрации субстрата. Концентрация несвязанного фермента (Е) равна общей концентрации фермента Ех минус концентрация комплекса ES:

[E] = [ET]-[ES]. (9)

Подставим это выражение в уравнение (8):

[ES] = ([ЕТ] - [ES]) [S]/XM. (10)

Решение уравнения (10) относительно [ES] дает

[ES] = [ЕТ]

(И)

[S]/ЈM 1 + [S]/KM

1/[S]

(14)

Максимальная скорость реакции Vmax достигается при насыщении активных центров фермента субстратом, т. е. когда [S] намного выше Км; при этом условии [S]/([S] + + Км) приближается к единице. Следовательно,

К™ = *э[Вг].

[S]

(15)

Подставив это выражение в выражение (13), мы получим уравнение Михаэлиса- Мен-тен:

V=V„

[S] + КМ ?

Это уравнение соответствует кинетическим данным, представленным на рис. 6.12. При низких концентрациях субстрата, когда [S] намного ниже Хм, V = [S] VmaJKM, т.е. скорость прямо пропорциональна концентрации субстрата. При высоких концентрациях субстрата, когда [S] намного выше, чем Км, V = Vmax, т. е. скорость реакции максимальна и не зависит от концентрации субстрата.

Значение Км выступает с очевидностью из уравнения (15). Если [S] = Км, то V = = Vmax/2, Таким образом, Км равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной.

или

[ES] = [ET]

Подставим выражение (12) в уравнение (2) [S]

V=k3 [ЕТ]

[S] + KM" Часть I

Конформации н динамика

6.10. Vmax и Км можно определить, используя различные концентрации субстрата

Если фермент работает в соответствии с простой схемой, представленной в уравнении (1), то нетрудно определить его константу Михаэлиса Км и максимальную скорость Кпах путем измерения скорости реакции при различных концентрациях субстрата. Удобно преобразовать уравнение Михаэлиса— Ментен в такую форму, чтобы графически

1

1

+

1

Т

оно выражалось прямой. Для этого уравнение (15) представляют в виде обратных величин:

(16)

Ям

[S]

Откладывая 1/У против 1/[S], получаем прямую, пересечение которой с осью ординат дает 1/Утлх, а угол наклона равен

^М^тах (РИС. 6.13).

фермент-субстратного взаимодействия. Следует еще раз подчеркнуть, что по значению Км можно судить о сродстве фермента к субстрату только при условии, что к2 значительно больше к3. В действительности так оно и бывает во многих, хотя и не во всех случаях.

Максимальная скорость Ктах