рменты снижают энергию активации катализируемых ими реакций

Химическая реакция А«=*В протекает через переходное состояние с более высокой энер6.5. Ферменты не сдвигают равновесия реакции

Фермент является катализатором, и, следовательно, он не может изменять равновесия химической реакции. Это означает, что фермент ускоряет как прямую, так и обратную реакцию в совершенно одинаковой степени. Рассмотрим взаимопревращение А в В. Пусть в отсутствие фермента скорость прямой реакции (fcnp) составит Ю-4 с-1, а скорость обратной (/с0бг) составит 10"6 с1. Константа равновесия К определяется соотношением этих скоростей:

ю-* с 1 A «=s В,

10~6 -1

10"

[В]

100.6

10

с

К [А] /собр

Таким образом, в состоянии равновесия концентрация В будет в 100 раз выше, чем концентрация А, независимо от того, присутствует фермент или нет. Однако в отсутГликопротеин Каталитическая единица I Модификатор специфичности

Рис. 6.6. Синтез лактозы - сахара, состоящего из остатков глюкозы и галактозы, происходит под действием фермента, который содержит каталитическую субьединицу и субъединицу, модифицирующую субстратную специфичность. Каталитическая субъединица в отсутствие субъединицы-модифика-тора катализирует другую реакцию.

= G

AG+ G,

субстрат

гией, чем энергия А или В. Скорость прямой реакции зависит от температуры и от разности значений свободной энергии для А и переходного состояния; эта разность называется свободной энергией активации Гиббса и обозначается AG^ (рис. 6.7,А):

переходное состояние

Скорость реакции пропорциональна количеству молекул, свободная энергия которых

равна или выше AG+. Доля таких молекул возрастает с повышением температуры.

Ферменты повышают скорость реакций путрм снижения активационного барьера AGT. При взаимодействии субстрата с ферментом реакция протекает по новому механизму, характеризующемуся более низкой энергией переходного состояния, чем реакции, протекающие в отсутствие фермента (рис. 6.7, Б).

6.7. Первый этап ферментативного катализа-образование фермент-субстратного комплекса

Образованию или расщеплению химических связей каким-либо ферментом предшествует формирование фермент-субстратного (ES) комплекса. При этом субстрат присоединяется к специфическому участку на ферменте, называемому активным центром. Большинство ферментов проявляет высокую избирательность в отношении связывания субстратов. В сущности, специфичность каталитического действия ферментов в основном зависит от специфичности процесса связывания. Более того, на этой стадии нередко осуществляется и регуляция ферментативной активности.

Существование фермент-субстратных комплексов было доказано разными способами.

1. ES-комплексы были непосредственно выявлены с помощью электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа. Комплексы нуклеиновых кислот и их полимераз видны под электронным микроскопом (рис. 6.3). При рентгеноструктурном анализе комплекса карбоксипептидазы А с ее субстратом глицил-Ь-тирозином была получена подробная информация относительно места и характера связывания субстрата с ферментом в этом ES-комплексе.

к

s i_ а. Ф i т

к

(0 X СГ о о о

CD

Без катализатора

о

о. ф

X

о

к

(О X

о о

3 о

Рис. 6.7.

А. Определение свободной энергии активации AGt. Б. Фермент ускоряет реакцию путем снижения AG |.

2. При образовании ES-комплекса нередко изменяются физические свойства фер-мента, например растворимость или термостабильность.

3. Спектроскопические характеристики многих ферментов и субстратов изменяются при образовании ES-комплекса подобно тому, как меняется характерный для дезок-сигемоглобина спектр поглощения при связывании кислорода или при окислении в ферриформу, что было описано ранее (рис. 3.18). Эти изменения проявляются особенно отчетливо, если фермент содержит окрашенную простетическую группу. Хорошей иллюстрацией может служить трипто-фан-синтаза - бактериальный фермент, содержащий в качестве простетической группы пиридоксальфосфат. Этот фермент катализирует синтез L-триптофана из L-серина и индола. При добавлении L-ce-рина к ферменту резко возрастает флуоресценция пиридоксальфосфатной группы (рис. 6.8). Последующее добавление второ500

Длина волны, нм

Рис. 6.8.

При добавлении субстратов реакции-серина и индола-изменяется интенсивность флуоресценции пиридоксальфос-фатной группы в активном центре триптофан-с интазы.

го субстрата - индола - гасит флу оресцен -цию до уровня ниже исходного. Таким образом, флуоресцентная спектроскопия позволяет выявить существование комплексов фермент—серии и фермент—серии—индол. Для изучения фермент-субстратного взаимодействия с успехом применяются и другие спектроскопические методы, в частности методы ядерного и электронного парамагнитного резонанса.

4. При образовании ES-комплекса проявляется высокая степень стереоспецифич-ности. Например, D-серин не может служить субстратом для триптофан-синтазы. Более того, D-изомер даже не связывается с ферментом. Из этого следует, что участок связывания субстрат