химический каталог




Биохимия. Том 3

Автор Л.Страйер

ржащей ColE1, обычно имеется 25 копий плазмиды. Обработка клеток хлорамфениколом блокирует синтез белка и репликацию клеточной хромосомы. Однако репликация ColE1 в этих условиях продолжается. В результате в клетках, обработанных хлорамфениколом, может накапливаться 1000 копий ColE1, так что количество этой плазмиды достигает примерно половины всей клеточной ДНК1.

Фаг X - другой удобный вектор. Большие участки его ДНК, имеющей в длину 48 kb, не являются необходимыми для литической инфекции или интеграции и могут быть замещены чужеродной ДНК. Были сконструированы мутантные фаги X, предназначенные для клонирования ДНК. Один из этих мутантов, который называется Xgt = X, содержит два участка расщепления EcoR1 вместо пяти, имеющихся в фаге дикого типа (рис. 31.24). После расщепления центральный участок молекулы ДНК этого фага X можно удалить. Два оставшихся куска ДНК составляют вместе 72% длины всего генома. Это количество ДНК недостаточно

1 Плазмида pBR322 создана на основе ColE1, поэтому она обладает способностью точно так же накапливаться в клетках в присутствии хлор-амфеникола.- Прим. перев.

31.11. Из суммарной геномной ДНК, расщепленной рестриктирующими эндонуклеазами, можно выделить с помощью клонирования определенные эукариотические гены

Как уже говорилось в предыдущей главе, исследование эукариотических геномов представляет огромные трудности. Ген длиной 1 kb составляет 2,5*10-4 генома Е. coli и всего лишь 3,4*10-7 генома млекопитающих. Методы рекомбинантных ДНК позволяют в настоящее время вводить эукариотический ген в Е. coli, что сильно упрощает задачу. Эксперимент начинается с частичного расщепления ДНК эукариотического генома, чтобы получить случайные фрагменты со средней длиной примерно 20 kb (рис. 31.25). К концам этих фрагментов присоединяют синтетические линкеры, образуют липкие концы и затем присоединяют к какому-нибудь вектору, например к ДНК фага X. При упаковке ДНК в вирионы in vitro происходит отбор рекомбинантных молекул ДНК, содержащих большие вставки. Затем этими рекомбинантными фагами заражают клетки Е. coli. Получается лизат, содержащий фрагменты эукариотической ДНК, заключенной в фаги и размноженной примерно в миллион раз. Этот лизат представляет собой библиотеку клонированной эукариотической ДНК.

Затем в такой библиотеке можно провести отбор для идентификации фаговых клонов, содержащих нужный эукариотический ген. Вычисление показывает, что лишь один из 180000 клонов будет содержать уникальный эукариотический ген. Поэтому необходима очень быстрая и эффективная процедура отбора. Она основана на гибридизации. Присутствие определенной последовательности ДНК в одной бляшке фага к можно выявить с помощью радиоактивной молекулы комплементарной ДНК или РНК в качестве гибридизационной пробы. Связывание этой пробы можно обнаружить методом радиоавтографии. Таким образом, можно проверить 1 млн. клонов за один день. Итак, клон, соответствующий определенному эукариотическому гену, можно легко идентифицировать и выделить при условии, что имеется транскрибированная с него РНК в более или менее чистом виде.

31.12. Эукариотические гены могут транскрибироваться в бактериальных клетках

Рекомбинантные молекулы ДНК, содержащие бактериальные гены, часто экспресси-руются в клетках Е. coli. Например, клонирование триптофанового оперона Е. coli в составе плазмидного вектора ColE1 приводит к образованию больших количеств пяти биосинтетических ферментов, закодированных в этом опероне. Количество этих ферментов примерно в 20 раз выше, чем в обычной клетке Е. coli, так как рекомби-нантная плазмида представлена многими копиями. ДНК дрожжей, простого эукарио-тического организма, также может экспрес-сироваться в бактериях. В одном исследовании в качестве клетки-хозяина использовали мутант Е. coli, нуждающийся в гистидине, так как он не содержал имидазолглицерол-фосфат-дегидрогеназы. При заражении этого мутанта фагом к, содержащим фрагмент дрожжевой ДНК, появилось несколько бактериальных клонов, которые уже не нуждались в экзогенном гистидине. Вставленный кусок дрожжевой ДНК нес недостающий ген, который экспрессировался с помощью механизмов транскрипции и трансляции бактериальной клетки.

Могут ли гены млекопитающих экспрес-сироваться в бактериях? Для ответа на этот вопрос в клетки Е. coli ввели ген инсулина крысы (рис. 31.26). Отправной точкой этого

комплементарная ДНК, синтезированная обратной транскриптазой на РНК-матрице.

исследования послужила инсулинома - опухоль поджелудочной железы, выделяющая большое количество инсулина. Эта опухоль богата мРНК препроинсулина, предшественника активного гормона (разд. 35.9). С помощью обратной транскрипции этой мРНК была получена двухцепочечная комплементарная ДНК (кДНК), а затем ее включили в плазмидный вектор. Почему именно кДНК, а не геномную ДНК ввели в Е. соШ Как мы уже говорили, многие эука-риотические гены содержат вставочные последовательности, которые вырезаются из первичных транскриптов (разд. 29.16). Поскольку бактерии, по всей вероятнос

страница 99
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193

Скачать книгу "Биохимия. Том 3" (2.99Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
мото магнитолы
опознавательные знаки такси в россии
дешево фото баннера
камеры хранения в москве стоимость

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(29.05.2017)