химический каталог




Биохимия. Том 3

Автор Л.Страйер

менты рестрикции и ДНК-лигаза -необходимые инструменты для получения рекомбинантных молекул ДНК

Молекулы ДНК можно легко соединять in vitro с помощью рестриктирующих эндону-клеаз (разд. 24.27), ДНК-лигаз (разд. 24.15) и других высокоспецифических ферментов, действующих на ДНК. В эксперименте по получению рекомбинантной ДНК вектор подготавливают к соединению с клонируемым фрагментом путем расщепления в одном определенном месте с помощью ре-стрикционной эндонуклеазы. Например, небольшую плазмиду pSC101 можно расщепить в одном месте ферментом рестрикции EcoR1. Если с помощью этого фермента две

цепи ДНК расщепить наискосок, то образуются комплементарные одноцепочечные концы (липкие концы). Предположим теперь, что фрагмент ДНК, который необходимо ввести в эту плазмиду, образован путем расщепления большой молекулы ДНК эндонуклеазой EcoR1. Тогда одноцепо-чечные концы этого фрагмента будут комплементарны концам расщепленной плаз-миды. Теперь фрагмент ДНК и плазмиду можно подвергнуть отжигу и соединить ДНК-лигазой (рис. 31.19). Затем бактерии инкубируют в присутствии этой смеси молекул ДНК. Небольшую часть бактерий, несущих плазмиду, отбирают, исходя из того что pSC101 сообщает клеткам устойчивость дезоксинуклеотидил-трансферазой (терминальной трансферазой) - ферментом, присоединяющим нуклеотиды к 3'-гидроксиль-ной группе цепи ДНК. Эта трансфераза в отличие от ДНК-полимеразы не зависит от матрицы, поэтому с ее помощью можно присоединить последовательности из ну-клеотидов только одного тина (обычно длиной 100 остатков). Ро1у^А)-концы одной молекулы ДНК отжигают с poly(dT)-конца-ми другой. Длины этих концевых последовательностей могут несколько колебаться, поэтому, прежде чем соединить цепи ДНК-лигазой, бреши заполняют с помощью ДНК-полимеразы I. Точно так же можно использовать для соединения различных молекул ДНК и концевые poly(dG)- и poly(dC)-последовательности.

Третий подход к соединению молекул

ДНК сочетает преимущества метода липких концов с универсальным характером (dA—dТ)-метода (коннекторного). К концам фрагмента ДНК или вектора ковалентно присоединяют химически синтезированный линкер, т.е. связующую цепь (длиной от шести до десяти пар оснований), чувствительный к расщеплению каким-либо ферментом рестрикции. 5'-концы десятинуклео-тидного линкера и молекулы ДНК фосфо-рилируют полинуклеотидкиназой и соединяют лигазой фага Т4, которая может образовывать ковалентную связь между молекулами ДНК с тупыми концами. Если обработать эти концевые участки соответствующим ферментом рестрикции, образуются липкие концы (рис. 31.21). Таким образом, почти у любой молекулы ДНК можно вызвать образование липких концов, соответствующих специфичности данного фермента рестрикции.

31.10. Плазмиды и фаг лямбда наиболее подходящие векторы

для клонирования ДНК в бактериях

Для увеличения эффективности проникновения рекомбинантных ДНК в клетку и облегчения отбора содержащих такие молекулы бактерий создаются новые векторы. Например, плазмида pBR322 содержит гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину (сходный с пенициллином антибиотик). Эту плазмиду пять различных рестриктаз расщепляют в каком-то одном определенном месте каждая (рис. 31.22). Введение ДНК в участок рестрикции EcoR1 не затрагивает генов устойчивости к антибиотикам. В то же время введение ДНК в участки рестрикции HindIII, SalI или BamHI приводит к инактивации гена устойчивости к тетрациклину; это явление называется инактивацией вставкой (инсерционной инактивацией). Клетки, содержащие pBR322 со вставленной ДНК, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину; поэтому их легко отобрать. Клетки, которые не смогли воспринять ДНК вектора, чувствительны к обоим антибиотикам, а клетки, содержащие pBR322 без вставки ДНК, к обоим антибиотикам устойчивы.

Другая группа векторов создана на основе плазмиды ColE1, кодирующей колицин Е - белковый токсин, убивающий некоторые штаммы Е. coli. Преимущество использования этих колициногенных плазмид в качестве

для упаковки в головку фага X. Длина ДНК, которая может быть легко упакована в головку, достигает 75-105% длины генома дикого типа. Однако достаточно длинный фрагмент ДНК (скажем, длиной 10 kb), вставленный между двумя концами ДНК фага X, позволяет такой рекомбинантной молекуле ДНК (93% генома) быть упакованной в головке (инкапсидироваться). Почти все инфекционные частицы X, образованные таким способом, будут содержать вставленный кусок чужеродной ДНК. Еще одно преимущество использования этих ви-рионов в качестве векторов состоит в том, что они проникают в бактерии с гораздо более высокой эффективностью, чем плаз-миды. К настоящему времени разработаны методы упаковки молекул ДНК in vitro с образованием инфекционных вирионов X. Для использования в качестве векторов были сконструированы самые разнообразные мутанты фага X. Некоторые из них могут служить векторами для вставок фрагментов ДНК, достигающих 40 kb.

векторов состоит в том , что их репликация не находится под строгим контролем. В клетке, соде

страница 98
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193

Скачать книгу "Биохимия. Том 3" (2.99Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
срочный ремонт холодильников индезит
скамья детская ск-2
приточная установка litened 50-25
билеты григорий лепс ноябрь

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.09.2017)