химический каталог




Биохимия. Том 3

Автор Л.Страйер

м Максамом и Уолтером Гилбертом (Allan Maxam, Walter Gilbert), основан на использовании ДНК, меченной 32Р по одному из концов одной из цепей. Для введения 32Р в 5'-гидро-ксильный конец обычно используют поли-нуклеотидкиназу. Меченую ДНК расщепляют предпочтительно по одному из четырех нуклеотидов. Условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую цепь приходился в среднем один разрыв.

разделения более длинных молекул более пористый агарозный гель. Если ДНК содержит радиоактивную метку, полосы можно выявить методом радиоавтографии. В другом случае гель можно покрасить бромистым этидием, который при связывании с двухспиральной ДНК флуоресцирует ярким оранжевым светом. При использовании этого способа можно легко увидеть полосу, содержащую 50 нг ДНК (рис. 24.49). Помимо чувствительности, важное достоинство таких гелей - их высокая разрешающая способность.

Частичное расщепление по каждому основанию дает набор радиоактивных фрагментов, начинающихся 32Р-меткой и кончающихся одним из положений этого основания. Например, если исследуемая ДНК имеет последовательность

5'-32P-GCTACGTA-3'

то в результате специфического расщепления с 5'-стороны каждого из четырех оснований получатся следующие радиоактивные фрагменты:

Затем эти фрагменты разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле, который дает возможность разделять молекулы ДНК, различающиеся по длине всего лишь на один нуклеотид. Следующий этап - радиоавтография этого геля. Как показано на рис. 24.50, самая нижняя полоса расположена на дорожке, соответствующей расщеплению по С, следующая - на дорожке Т, затем еще одна - на дорожке А. Следовательно, последовательность первых трех нуклеотидов имеет вид 5'-СТА-3'. Если прочитать все семь полос снизу вверх, получится последовательность 5'-CTACGTA-3'. Итак, радиоавтограф геля, полученного после четырех различных реакций химического расщепления, дает набор полос, по которым можно непосредственно прочитать нужную последовательность.

Как достигается специфическое расщепление ДНК? Для этого используют соединения, которые способны модифицировать основание и затем отщеплять его от остатка сахара (рис. 24.51). Пурины модифицируют диметилсульфатом, метилирующим гуанин по N-7 и аденин по N-3. Расщепление гликозидной связи метилированного пурина легко достигается нагреванием при нейтральном значении рН.

В результате основание отделяется от соответствующего остатка сахара. Затем смесь нагревают в щелочи, что вызывает расщепление сахарофосфатного остова ДНК и удаление остатка сахара. В результате образуются фрагменты, несущие на конце метку. Эти фрагменты разделяют в полиакриламидном геле и на радиоавтографе получают картину полосы различной интенсивности. Темные полосы соответствуют фрагментам, образовавшимся при расщеплении по гуанину, так как гуанин метилируется гораздо быстрее, чем аденин. В то же время гликозидная связь в метилированном аденозине менее стабильна, чем в метилированном гуанозине. Поэтому при обработке разбавленной кислотой после метилирования происходит предпочтительное выщепление аденина (получается дорожка А + G). Сравнение дорожки А + G с параллельной дорожкой G на том же геле показывает, происходит ли расщепление по А или по G (рис. 24.52). Расщепление по цитозину и тимину проводят гидразином. Остов затем расщепляют

пиперидином, который вытесняет продукты реакции с гидразином и катализирует элиминацию фосфатов. В результате расщепления по цитозинам и тиминам получают серию полос примерно равной интенсивности (дорожка С + Т). Эти пирими-дины различают, проводя гидразинолиз в присутствии 2 М NaCl, подавляющим реакцию с тимином (дорожка С). Теперь последовательность ДНК можно прочитать по радиоавтографу геля, сопоставляя дорожки G, A + G, С + Т и С (рис. 24.52).

Самый короткий фрагмент имеет самую высокую электрофоретическую подвижность, так что 5'-концу соответствует низ геля. Если использовать несколько различных гелей для разделений всех меченых фрагментов, можно легко определить таким образом последовательности длиной более 150 пар оснований.

24.29. Полная последовательность оснований ДНК фага фХ174 была определена с помощью метода ферментативной репликации

Другой метод определения последовательности оснований в ДНК основан на образовании меченых фрагментов с помощью контролируемого прерывания ферментативной репликации in vitro. Этот метод разработали Фред Сэнгер (Fred Sanger) и его сотрудники. Для считывания определенной последовательности с одноцепочеч-ной ДНК используют ДНК-полимеразу

В качестве затравки для синтеза используется комплементарный фрагмент, который можно получить из набора продуктов рестрикции, соответствующей двух-цепочечной ДНК. Кроме четырех радиоактивных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, инкубационная смесь содержит 2,3-диде-зоксианалог одного из них. Включение этого аналога блокирует дальнейший рост цепи, так как он не содержит концевой 3'-гидроксильной группы, необходимой для образования следующей фосфодиэфирной связи. Так образуются

страница 16
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193

Скачать книгу "Биохимия. Том 3" (2.99Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
http://taxiru.ru/shashki-dlya-taxi-all/
шкаф картотечный купить
выправка крыла цена москва
купить билет на hurts

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.09.2017)