химический каталог




Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот

Автор А.С.Спирин

ймер| GA[A] |праймер| GA ATTCGC [А]

Рис. 7. Схема, иллюстрирующая принципы секвенирования ДНК по Сэнгеру Показана терминация только по остаткам А

ДНК-полимеразной реакции (рассматриваемой в гл. II при обсуждении репликации ДНК). Принцип метода показан на рис 7 Как и при секвенировании ДНК по Максаму — Гилберту, здесь добиваются, чтобы обрыв цепи (при попадании на ее З'-конец комплементарного терминаторного нуклеотидного остатка) происходил равновероятно по всем положениям данного остатка (рис. 7 — остаток Т). Это достигается экспериментальным выбором «править ного» соотношения дезоксинуклеозидтрифосфатов и терминаторного 18

езоксинуклеозидтрифосфата. в ИТоГе в каждой из четырех реакционных смесей образуются примерно в равных количествах молекулы комплементарных полинуклеотидов, синтез которых остановлен на анализируемом нуклеотидом остатке.о—рДля секвенирования ДНК по Сэнгеру созданы универсальные конструкции (на базе генома фага М13) для встраивания в них изучаемого фрагмента *, позволяющие применять универсальный праймер. Метка вводится в праймер или по а-фосфатной группе нуклеозидтрифосфата. В последнем случае это может быть не только меченый атом фосфора (32Р, например), но и атом серы (35S), заменяющий атом кислорода:

Меченые фрагменты разделяют так же, как и при секвенировании ДНК по Максаму — Гилберту.

В настоящее время существует множество вариантов как метода Максама — Гилберта, так и метода Сэнгера. Главное, эти методы удалось полностью автоматизировать. Так, например, при секвенировании ДНК по Сэнгеру на 5'-конец праймера вводят флуоресцентные метки, причем для каждого из четырех анализируемых нуклеотидов используются флуоресцирующие агенты с различными спектральными характеристиками. После электрофоретического разделения гель сканируется при четырех различных длинах волн и полученная информация сразу обрабатывается на ЭВМ. При этом все биохимические операции также проводятся роботом.

Применение автоматов позволяет в принципе определять полную нуклеотидную последовательность ДНК, составляющей геном любого организма, включая геном человека.

Определение нуклеотидной последовательности РНК

Размеры полинуклеотидных цепей РНК колеблются от нескольких десятков и сотен (транспортные, малые рибосомные, малые ядерные РНК) до нескольких тысяч (рибосомные, информационные и вирусные РНК) нуклеотидных остатков.

Таким образом, полная нуклеотидная последовательность многих классов РНК (длиной до 250—300 н. о.) может быть прямо оп* Методы получения рекомбинантных ДНК в этой книге не рассматри-^ются- Читателям рекомендуется обратиться к руководствам по генетичеинженерии, приведенным в конце этой главы.

»9

? 5'pNpN...pN3apCp

ределена с помощью одного из вариантов метода Максама — Гилберта. Как и в случае фрагментов ДНК, на один из концов РНК вводится радиоактивная метка. Наряду с фосфорилированием 5'-конца полинуклеотидиой цепи (с помощью полинуклеотидкиназы и •у-[32Р]-АТР) здесь применяется введение радиоактивной метки на З'-конец молекулы. Для этого к З'-концевой ОН-группе РНК лришивают меченый по 5'-фосфатной группе цитидин —3', 5'-дифосфат (5'-[3!Р]-рСр) с помощью фермента РНК-лигазы:

5'pNpN.. .pN—ОНЗ'-^рСр Наряду с химическим расщеплением секвенирование РНК можно проводить путем гидролиза ее цепи специфическими РНК-азами .

Часто для определения нуклеотидной последовательности достаточно протяженной полинуклеотидиой цепи РНК наиболее простым оказывается секвенирование гена (т. е. ДНК), в котором эта РНК закодирована. В тех случаях, когда это сделать затруднительно, применяется секвенирование РНК по Сэнгеру с использованием обратной транскриптазы вместо обычной ДНК-полимеразы. Этот фермент, закодированный в геноме многих вирусов (см. гл. 13, раздел 3), синтезирует на РНК-матрице комплементарную ей полиде-зоксирибонуклеотидную цепь. Для его работы требуется затравка (праймер) со свободным З'-концом, в качестве которой используется олигонуклеотид, комплементарный З'-концевой части РНК. Для полиаденилированных РНК (см. гл. VIII, раздел 4) затравкой служит олиготимидиловая кислота. В других же случаях требуется дополнительная информация о первичной структуре З'-концевого участка РНК, на основании которой химически синтезируют олигонуклеотид—затравку. Само же секвенирование проводится так, как показано на рис. 7.

2. МАКРОМОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Макромолекулярная структура ДНК

а. Двойная спираль ДНК. Модель Уотсона и Крика

В 1953 г. Дж. Уотсон и Ф. Крик, опираясь на известные данные о структуре мономерных остатков нуклеиновых кислот и открытое Э. Чаргаффом правило, согласно которому в любой ДНК количество аденина равно количеству тимина, а количество гуанина — количеству цитозина (А=Т, G=C), расшифровали рентгенограммы псевдокристаллической формы (ориентированных волокон) ДНК- Согласно их модели, молекула ДНК представляет собой правильную спираль, образованную двумя полину-клеотидными цепями, закрученными друг относительно друга и вокруг общей оси. Диаметр спирали

страница 5
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135

Скачать книгу "Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот" (5.58Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить букет из подсолнухов в москве
купить отпечаток ручек и ножек
снять машину с лицензией такси
купить билеты на филиппа киркорова

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(07.12.2016)