химический каталог




Практикум по биологической химии

Автор Д.К.Шапиро

ную жидкость сливают, соединяют ее с промывными водами, полученными в первом этапе. В жидкой фракции определяют содержание РНК.

В осадке остаются ДНК и белки.

4. Осадок растворяют в 0,5 н растворе КОН при 37° С, затем охлаждают до 0° С. Раствор сливают и в нем определяют содержание ДНК. Осадок нерастворимых веществ выбрасывают.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДНК (но Дише)

При нагревании деэоксирибозы с раствором дифениламина в смеси ледяной уксусной и серной кислот развивается синее окрашивание, имеющее максимум поглощения при 595 нм.

Механизм реакции заключается в образовании окси-левулинового альдегида и конденсации последнего с дифениламином с образованием окрашенного соединения.

Реактивы: а) раствор или суспензия ДИК, 50 -500 мкг/мл (приготовление — см. предыдущую работу); б) реактив Дише; 1 г дифениламина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты. К раствору прибавляют 2,75 мл концентрированной серной кислоты.

Примечание. Для приготовления реактива Дише рекомендуется брать дифениламин, дважды перекрксталлизоватшй из 70%-иого этилового спирта.

К 1—2 мл раствора (или суспензии) ДНК приливают двойной объем реактива Дише, нагревают 10 мин. иа кипящей водяной бане, затем охлаждают. Жидкость окрашивается в синий или сине-фиолетовый цвет. Измеряют поглощение раствора в фотоэлектроколориметре с красным (лучше оранжевым) светофильтром (595 нм) против контроля (реактив Дише).

Содержание ДНК в исследуемом растворе рассчитывают по калибровочной кривой, составленной по стандартному раствору натриевой соли дезоксирибонуклеи-новой кислоты с известным содержанием фосфора (9,89—10,0%! в пересчете на чистую ДНК).

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РНК (по Мейбаум)

В основу метода положена известная реакция пентоз с орцином (см. раздел «Химия и обмен углеводов»).

Реактивы: а) хлорное железо (FeCl3 • 6П20), в, 1%-ный раствор в концентрированной соляной кислоте; б) орцин (5-метилрезорцин): раствор (10 мг/мл) готовят перед употреблением на солянокислом растворе хлорного железа (см. выше); в) раствор РНК, 10—15 жг1мл (приготовление — см. «Очистка и разделение нуклеиновых кислот»).

К 2 мл раствора РНК прибавляют столько же раствора орцина, нагревают 20 мин. на кипящей водяной бане и охлаждают под краном. Жидкость окрашивается в зеленый или синевато-зеленый цвет.

Измеряют поглощение раствора в фотоэлектроколориметре с красным фильтром (670 нм). Содержание РНК вычисляют по калибровочной кривой, составленной по стандартным растворам РНК или рибозы. Предложена модификация метода Мейбаум, повышающая точность определения: после охлаждения окрашенный продукт экстрагируют изоамиловым спиртом, центрифугируют. Измеряют поглощение спиртовой фракции при 670 нм. против контроля (раствор орцина), обработанного таким же образом, как и испытуемая проба.

Содержание РНК рассчитывают по калибровочной кривой.

ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИНОВЫХ ОСНОВАНИИ, НУКЛЕОЗИДОВ И НУКЛЕОТИДОВ*

* Для студенческого научно-исследовательского кружка.

Общие сведения. В биологическом материале свободные иуриновые и пиримидиновыс основания встречаются в небольших количествах. Они, как известно, являются компонентами дезокскрибонуклеиновых и нуклеиновых кислот и освобождаются при их гидролитическом расщеплении. Подвергая гидролизу ДНК действием концентрированных растворов минеральных кислот (например, 6 и соляной кислоты или 12 н хлорной) при 100° С, можно добиться почти количественного освобождения пу60

61

риновых и пирнмиднконых оснований. Для высвобождения нуклеозидов и нуклеотидов следует применять более мягкий метод — энзим этический.

Значительно легче гидролизуютея рибонуклеиновые кислоты. Уже 1н раствор серной или соляной кислот расщепляют РНК до пуриновых оснований и пиримидиновых нуклеотидов. Этот способ гидролиза позволяет установить неодинаковую прочность гликозидных связей в пуриновых и пиримидиновых нуклеотидах, так как последние в описанных условиях почти не подвергаются дальнейшему расщеплению. Пиримидиновые основания освобождаются лишь при гидролизе РНК 12 н раствором хлорной кислоты (1 ч при 100° С).

Для того чтобы выделить свободные мононуклеотиды, проводят гидролитическое расщепление РНК 0,3 н раствором едкого натра в течение 18 ч при температуре 37° С.

Стандартные растворы. Готовят раствор свободных пуриновых и пиримидиновых оснований (2 мг/мл) в 10%-ном растворе изопропанола, к которому добавляют 10% уксусной кислоты.

Гуанин растворяют (в количестве 1 мг/мл) в 0,1 н растворе соляной кислоты.

Нуклеозиды и нуклеотиды (в концентрации 4 мг/мл) растворяют в 10%-ном растворе изопропанола. Их стандартные растворы сохраняют в морозильной камере холодильника при температуре —15° С.

На хроматограммы наносят по 5—10 мкл растворов.

Системы растворителей. Употребляют следующие системы растворителей.

I. Смесь бутанола, уксусной кислоты и воды (12 :3 :

: 5). Применяют для разделения смеси оснований, а также пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов и нуклеотидов.

II. Смесь изопропанола, конц

страница 20
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86

Скачать книгу "Практикум по биологической химии" (2.2Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить цветы на радиатор на свадьбу
Рекомендуем фирму Ренесанс - модульные лестницы в леруа мерлен - доставка, монтаж.
кресло ch 626
хранение москва

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)