химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

т. Для переведения смолы в Cl-форму осадок заливают 20—30 мл 1 н. раствора НС1, перемешивают и оставляют на 30 мин. Затем промывают водой до нейтральной реакции. Промытую смолу взмучивают в небольшом количестве воды и заполняют колонку так, как описано на с. ПО. Перед нанесением пробы колонка должна быть уравновешена 1 н. раствором NH4OH, с которого будет начата хроматография. Для этого пропускают б—8 объемов (около 100 мл) 1 н. раствора аммиака.

Разделение нуклеотидов. Наносят на колонку опытный раствор, содержащий 10—12 мкмоль нуклеотидов в 1—2 мл 1 н. раствора NH4OH. Колонку промывают водой до нейтральной реакции. Элюцию нуклеотидов осуществляют с помощью ступенчатого градиента. Для этого последовательно пропускают через колонку следующие растворы: 0,01 М раствор NH4CI (150—200 мл), 0,003 н. раствор НС1 — для элюции АМФ (около 300 мл). Как только рН элюата достигает 3,0, начинают собирать при помощи коллектора фракции по 3 мл и анализируют их при 260 нм. Элюцию продолжают до тех пор, пока экстинк-ция не снизится до 0,05. Далее пропускают 0,02 М раствор NaCl в 0,01 н. НС1 — для элюции АДФ (около 200 мл), после этого 0,2 М раствор NaCl в 0,01 н. НС1 —для элюции АТФ (около 200 мл). Фракции собирают и анализируют при 260 нм.

Для характеристики и количественного определения нуклеотидов фракции, соответствующие отдельным пикам на кривой эволюции, объединяют и анализируют. Концентрирование фракций осуществляют лиофилизацией

После окончания хроматографического разделения смолу регенерируют промыванием 2 н. раствором НС1 с последующим отмыванием водой до нейтральной реакции.

2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ АДЕНИЛОВОЙ СИСТЕМЫ

Спектрофотометрическое определение по аденину. Определение ос-новачо на том, что аденин и его производные имеют максимум поглощения при —260 нм, коэффициент молярного поглощения при рН 2,0 (см. Приложение, с. 499).

Участки хроматограммы или электрофореграммы, поглощающие в ультрафиолетовой области спектра, вырезают, измельчают и элюируют <),01 н. раствором НС1 в течение 4 ч. В элюате определяют оптическую плотность при 260 нм. Для учета содержания примесей, имеющих поглощение в той же области спектра, определяют оптическую плотность при 290 нм и по разности (Лгео—^290) рассчитывают содержание аде-ниловых нуклеотидов (с. 499).

Определение по фосфору. Исследуемый раствор нуклеотидов или элюаты из участков бумаги или сорбента, содержащие АТФ, АДФ и АМФ, помещают в колбочки для сжигания. В качестве контроля используют растворы или элюаты из участков бумаги, не содержащие адениловых нуклеотидов. Проводят минерализацию проб и определяют неорганический фосфат по методу Фиске—Суббароу (с. 34).

Определение по пентозе проводят так, как описано ранее (с. 164).

И. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НИКОТИНАМИДНЫХ КОФЕРМЕНТОВ В ЖИВОТНЫХ ТКАНЯХ

Динуклеотиды НАД+, НАДН, НАДФ+ и НАДФН выполняют функции коферментов в окислительно-восстановительных реакциях. Раздельное определение окисленной и восстановленной форм никоти-намидных коферментов основано на различной устойчивости их в разбавленных растворах кислот и щелочей. НАД+ и НАДФ+ относительно устойчивы в кислой среде и легко разрушаются в щелочной, особенно при нагревании: НАДН и НАДФН, напротив, устойчивы в щелочной среде и быстро разрушаются в растворах кислот.

Реактивы:

1. НСЮ4 — 0,5 н. раствор. 2 КОН —40%-ный раствор. 3. INA2C03 —0,1 М раствор.

1 Цистеин —0,02 М раствор, готовится непосредственно перед

использованием. 5 Яблочная кислота— 1 М раствор.

6. Калий-фосфатный буфер — 0,05 М раствор, рН 7,8.

7. Семикарбазид-НС1 — 0,1 М раствор, рН 7,8. 8 Этиловый спирт.

9. Алкогольдегидрогеназа—1 мг/мл.

10. Феназинметасульфат — 1 мг/мл.

11. Глицил-глициновый буфер —0,1 М раствор, рН 7,5.

12 MgCl2-6H20 — 0,033 М раствор.

13 Глюкозо-6-фосфат — 0,025 М раствор.

14 Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

1 47

Только что извлеченную из организма ткань (печень, мышцы, сердце) помещают в ступку с жидким азотом, замораживают и измельчают в порошок. Взвешивание ткани следует проводить очень быстро, чтобы не произошло ее размораживания.

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НАД+ И НАДФ+

Для извлечения окисленных нуклеотидов навеску замороженной измельченной ткани (1 г) помещают в 4-кратный объем охлажденной 0,5 н. НСЮ4 и растирают на холоде в ступке с кварцевым песком в течение 5—10 мин для лучшей экстракции. Осадок ткани удаляют центрифугированием при 12 000 g, надосадочную жидкость сливают в охлажденные мерные центрифужные пробирки и нейтрализуют 40%-ным раствором КОН до рН 7,0. Осадок перхлората калия удаляют центрифугированием. В нейтральном экстракте определяют содержание НАД+ и НАДФ^.

Определение НАД+, Метод основан на специфической реакции восстановления НАД+ алкогольдегидрогеназой в присутствии этанола:

НАД++CHsCH2OH ~ "'"""?rm-^ НАДН+Н+ + СН3СНО.

Реакцию сдвигают вправо добавлением к реакционной смеси семикар-базида, который необратимо реагирует с ацетальдегидом. О количестве НАДН судят по нарастанию поглощения при 340 нм (с. 7).

В

страница 95
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
беспружинных ортопедических матрасов детский 80-160
Предлагаем приобрести в КНС проектор короткофокусный купить - мегамаркет компьютерной техники.
магнитный ограничитель хода двери
запчасти для холодильника шарп

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(26.06.2017)