химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

тионооб-менной смолой в Н+-форме. Элюат собирают, колонку промывают трижды 3 мл воды. Фракции объединяют и упаривают на роторном испарителе. Осадок растворяют в минимальном объеме воды и фракционируют рибомононуклеотиды методами электрофореза или хроматографии.

РАЗДЕЛЕНИЕ РИБОМОНОНУКЛЕОТИДОВ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НА БУМАГЕ

Для разделения рибомононуклеотидов используют низковольтный (градиент напряжения 15—20 В/см), средневольтный (Д?У = 30— 40 В/см) или высоковольтный (AU = 50—80 В/см) электрофорез на бумаге.

Реактивы:

1. Ацетатно-аммонийный буфер — 1,4 М раствор, рН 3,5. Для приготовления буфера 2 М СН3СООН титруют концентрированным NH4OH до рН 3,3 и доводят водой до концентрации 1,4 М по ацетату; буфер может храниться длительное время.

2. НС1 —0,01 н. раствор.

3. Растворы рибомононуклеотидов-«свидетелей» (адениловой, гуа-ниловой, уридиловой и цитидиловой кислот)—0,01 М.

4. Хроматографическая бумага — ленинградская (промытая, см. с. 178), ватман № 1, ватман 3 MM, FN 14—17.

Низковольтный электрофорез. Описание камеры для низковольтного электрофореза приведено на с. 89. В кюветы наливают 0,07 М ацетатно-аммонийный буфер, который получают разведением раствора № 1; рН полученного раствора проверяют на потенциометре: он не должен превышать 3,4—3,5.

На полоски хроматографической бумаги шириной 4—5 см на линию старта наносят щелочной гидро'лизат РНК (10—20 мкл) и растворы нуклеотидов-«свидетелей» по 0,1—0,15 мкмоль каждого. Электрофорез проводят в течение 5 ч при силе тока 0,5 мА на 1 см поперечного сечения бумаги. Для определения времени окончания электрофо-ретического разделения можно использовать окрашенный маркер, например 1%-ный раствор ксиленцианола, который движется быстрее самого подвижного компонента смеси. Локализацию рибомононуклео-тидов проводят в ультрахемископе. Подвижность нуклеотидов от катода к аноду возрастает в ряду: цитидиловая, адениловая, гуаниловая и уридиловая кислоты. Для количественного определения участки электрофореграмм, поглощающие в ультрафиолетовой области, очерчивают простым карандашом, вырезают, измельчают и элюируют нуклеотиды 4—5 мл 0,01 н. раствора НС1 в течение 4—5 ч. В элюатах определяют поглощение на спектрофотометре при длине волны, характерной для каждого нуклеотида (см. Приложение, с. 499), рассчитывают количество их в микромолях и в процентах по отношению к сумме всех нуклеотидов в щелочном гидролизате РНК.

Средневольтный электрофорез (описание прибора см. на с. 138). В качестве электродного буфера используют ацетатно-аммонийный буфер 0,15 М, который получают разведением реактива № 1 (рН не должен превышать 3,4—3,5). Электрофоретическое разделение проводят в течение 3 ч при градиенте напряжения 30 В/см.

РАЗДЕЛЕНИЕ РИБОМОНОНУКЛЕОТИДОВ МЕТОДОМ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ

Реактивы:

1. Ацетатно-аммонийный буфер — 1 М, рН 3,7. Для приготовления буфера 2 М раствор СН3СООН титруют концентрированным NH4OH до рН 3,7 и доводят водой до концентрации 1 М по ацетату.

2. Этиловый спирт.

3. w-Бутиловый спирт.

4. Аммиак концентрированный.

5. Изомасляная кислота.

6. Стандартные растворы рибомононуклеотидов-«свидетелей» — 0,01 М растворы.

7. Хроматографическая бумага — ленинградская, промытая (с. 178), FN 14—17.

Разделение проводят методом нисходящей хроматографии (с. 126) путем последовательного пропускания двух различных растворителей. Состав первого растворителя: этиловый спирт — w-бутанол — ацетатно-аммонийный буфер в соотношении 4:1:2. Состав второго растворителя: изомасляная кислота — аммиак — вода в соотношении 50 : 1 : 27 (рН 3,5—4,0).

На листы хроматографической бумаги соответствующего размера наносят растворы нуклеотидов-«свидетелей» (адениловой, гуаниловой^ цитидиловой и уридиловой кислот) и анализируемой смеси рибомоно-нуклеотидов после щелочного гидролиза РНК в количестве, соответствующем 0,05—ОД мкмоль каждого нуклеотида. Хроматограмму помещают в камеру, насыщенную первым растворителем, и пропускают его около суток (на вытекание). Затем хроматограмму вынимают, высушивают и помещают в камеру со вторым растворителем, который также пропускают — 24 ч.

При последовательном пропускании двух растворителей достигается хорошее разделение рибомононуклеотидов. Rf увеличивается в ряду: адениловая, цитидиловая, уридиловая и гуаниловая кислоты. Обнаружение и количественное определение нуклеотидов ? проводят так же, как после электрофоретического разделения (с. 181).

РАЗДЕЛЕНИЕ РИБОМОНОНУКЛЕОТИДОВ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Для разделения рибомононуклеотидов используют ионообменную тонкослойную хроматографию. Для этой цели можно использовать готовые пластинки с катионообменником «Фиксион 50X8» в Н+-форме (с. 133) или с анионообменниками на основе целлюлозы: с ДЭАЭ-, Эк-теола- и ПЭИ-целлюлозой. При наличии анионообмениика пластики могут быть изготовлены в лаборатории.

Реактивы:

1. СНзСООН— 1 н. раствор.

2. UC1 —0,3 М раствор.

3. Растворы рибомононуклеотидов-«свидетелей» — 0,005 М.

4. Полиэтилениминцеллюлоза.

Приготовление

страница 92
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Кликните, выгодное предложение от KNS c промокодом "Галактика" - CE743A - супермаркет компьютерной техники.
купить матрац на кровать
купить этажерку деревянную
красивые заборы из сетки рабицы

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.01.2017)