химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

— концентрированная НС1— вода в соотношении 34 : 9 : 70.

5. Стандартные растворы оснований ДНК — аденина, гуанина, ти-мина, цитозина, 5-метилцитозина — 0,005 М в Н20 или 0,05 н. NaOH.

28 При использовании 57%-ного раствора НС104 к осадку приливают 0,05—

0,1 мл кислоты и время гидролиза увеличивают до 2 ч.

29 Для удаления примесей, поглощающих в ультрафиолетовой области спектра,

хроматографическую бумагу типа «ленинградская» следует промыть 2 н. раствором

уксусной кислоты и затем отмыть дистиллированной водой до нейтральной реакции.

Разделение оснований ДНК проводят методом нисходящей хроматографии (с. 126). Растворитель заливают в камеру и оставляют на ночь для насыщения. На линию старта наносят по 0,05—0,1 мл гидролизата ДНК. На эту же хроматограмму наносят растворы оснований-свидетелей» в количестве 0,05—0,07 мкмоль. Процесс разделения длится от 20 до 40 ч. Локализацию азотистых оснований проводят в ультрахемископе. Расположение оснований в порядке удаления от венного определения оснований в гидролизатах соответствующие участки хроматограмм элюируют 4 мл 0,1 н. НС1 при 37°С в течение ночи и спектрофотометрируют против элюатов, полученных из контрольных участков хроматограммы. Оптическую плотность измеряют при длине волны, характерной для максимума поглощения данного основания (с 499), а для учета неспецифического поглощения — при 290 нм Определив АЛ для каждого нуклеотида и пользуясь коэффициентом молярного поглощения, вычисляют содержание каждого нуклеотида в пятне. Определяют его процентное содержание по отношению к общему количеству нуклеотидов.

РАЗДЕЛЕНИЕ ОСНОВАНИЙ ДНК МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Хроматография на целлюлозе «Фильтрак»

Реактивы:

1. Целлюлоза «Фильтрак» (ГДР).

2. NaOH — 0,5 н. раствор.

3. НС1 — 0,5 н. раствор.

4. Реактивы для хроматографического разделения оснований ДНК на бумаге (с. 178).

Приготовление пластинок. 20 г целлюлозы суспендируют в 150— 200 мл Н20 до получения густой равномерной суспензии и наносят пипеткой с широким отверстием по 30 мл на стеклянные пластинки размером 24x10 см, предварительно тщательно вымытые и протертые эфиром. При нанесении суспензии пластинки должны располагаться строго горизонтально для получения ровного слоя носителя. Пластинки высушивают на воздухе в течение суток.

Проведение хроматографического разделения. На пластинки на расстоянии 4 см от нижнего края и 1,5 см друг от друга наносят капилляром растворы «свидетелей» (по 0,05—0,07 мкмоль) и гидролизат ДНК (по 20—50 мкл). Все растворы следует наносить маленькими порциями и подсушивать теплым воздухом. Пластинку помещают в камеру, насыщенную растворителем. Хроматографическое разделение длится 4—б ч. Пластинку высушивают на воздухе и определяют локализацию азотистых оснований в ультрахемископе. Если разделение произошло недостаточно четко, хроматографический процесс повторяют. Для количественного определения оснований пятна на пластинках обводя г простым карандашом и целлюлозу осторожно соскабливают скальпелем или бритвой в пробирки. Приливают в них по 2— 3 мл 0,5 н. НС1 и проводят элюцию в течение 10—15 ч при 37°С, периодически встряхивая. Осадок отделяют и в растворе определяют концентрацию азотистых оснований спектрофотометрически, пользуясь таблицей на с. 499.

Поскольку гуанин плохо растворим в щелочном растворителе, для его количественного определения рекомендуется проводить разделение в кислой системе. Стандартный раствор гуанина готовят при подкис-лении.

Хроматография на пластинках «Силуфол»

На пластинках «Силуфол UV-254» простым карандашом отмечают точки на расстоянии 2,5 см от нижнего края и 1,5 см друг от друга.

В них наносят капиллярами или автоматическими микропипетками 1—2 мкл гидролизата ДНК и растворов оснований-«свидетелей» (5— 10 нмоль). Пятна подсушивают теплым воздухом. Пластинки помещают в хроматографические камеры, насыщенные растворителем. Используют те же растворители, что и при хроматографии на целлюлозе «Фильтрак». Когда растворитель поднимется на 4/5 высоты пластинки, ее вынимают, высушивают под тягой и просматривают в ультрахе-мископе. Пятна оснований четко локализованы благодаря флуоресцирующему носителю.

2. НУКЛЕОТИДНЫЙ СОСТАВ РНК

Для определения нуклеотидного состава РНК подвергают гидролитическому расщеплению. При кипячении с минеральными кислотами РНК, как и ДНК, расщепляется на составляющие компоненты — азотистые основания, рибозу и фосфор. В 0,5—1 н. растворе щелочи РНК гидролизуется до нуклеотидов, в то время как ДНК щелочному гидролизу не подвергается и примесь ее может быть отделена в виде осадка.

Щелочной гидролиз РНК

Реактивы:

1. NaOH — 0,75 н. раствор. \

2. Катионообменная смола Дауэкс-50, Амберлит IRC-50 или КРС-8п в Н+-форме. Подготовку смолы см. на с. 109.

К 100—200 мг РНК добавляют 0,75 н. NaOH из расчета 1 мл щелочи на 100 мг препарата и проводят гидролиз при 37°С в течение 18 ч. После гидролиза суспензию охлаждают и для удаления ионов Na+ тотчас наносят на колонку (0,5x3 см), заполненную ка

страница 91
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
керамический декор decor memories azul-2
med иммобилайзер схема подключения
Сковороды BAF интернет магазин
концерты в москве 2 декабря 2016

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)