химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

творе № 1.

3. РНКаза из поджелудочной железы быка (0,15—0,25 Е/мл) — 0,5—2 мкг/мл ацетатного буфера.

За единицу активности принимают количество фермента, вызывающее уменьшение оптической плотности АЛзоо на 1 ед. при инкубации с 0,05%-ным раствором РНК при рН 5,0 и t°=25°C в течение 1 мин.

4. NaCl —0,05 М раствор.

5. Сефадекс G-25 или G-50.

Колонку размером 1X20 см заполняют набухшим гелем (с. 106) и уравновешивают 0,05 М NaCl. К 1 мл раствора РНК добавляют 1 мл раствора РНКазы и оставляют на 2 ч при 37°С. После инкубации смесь охлаждают и тотчас наносят на колонку. Элюцию проводят 0,05 М NaCl. Собирают фракции по 3 мл и определяют в них оптическую плотность при 260 нм. Рекомендуется также измерять поглощение при 300 нм, так как в данной области спектра находится максимум поглощения полимерной РНК. Строят график зависимости оптической плотности от номера фракции или объема элюента.

х ж VH' х J- vy jj-j. ' X i.j л ii ji l/l ЛД 'AJ 1 t V_* X Л J~X -** X X/1 1 Ш A W A i-X\A_j

С ДЭАЭ-ЦЕЛЛЮЛОЗОЙ

Олигонуклеотиды несут большой отрицательный заряд, поэтому они с успехом могут быть разделены на слабых крупнопористых анио-нообменниках. Для этой цели используют колонки, заполненные ДЭАЭ-сефадексом, ДЭАЭ-целлюлозой, Эктеола-целлюлозой и др. Нук-леотиды элюируются с колонки в градиенте концентрации NaCl в порядке увеличения их молекулярной массы. Для подавления неспецифической сорбции нуклеотидов на полисахаридных матрицах хроматографию проводят в присутствии 7 М мочевины.

Реактивы:

1. NaCl — 2 М раствор.

2. Трис-HCl буфер —0,005 М, рН 7,8.

3. NaCl — 0,02 М, готовят на растворе № 2.

4. NaCl — 0,02 М, готовят на растворе № 2 и добавляют мочевину до 7 М {стартовый буфер).

5. NaCl — 0,3 М раствор, готовят на растворе № 2 и добавляют мочевину до 7 М.

6. ДЭАЭ-целлюлоза.

Колонку размером 1X20 см наполняют ДЭАЭ-целлюлозой. Подготовку ионообменника и заполнение колонки см. на с. 109. Сорбент промывают 2 М NaCl до тех пор, пока поглощение элюата при 260 нм не станет менее 0,02. Затем колонку промывают 5—10 объемами 0,005 М трис-буфера, рН 7,8.

Гидролизат РНК (с. 176) или фракцию рибонуклеотидов, полученную в результате гель-фильтрации (с. 176), разбавляют так, чтобы концентрация солей в нем была менее 0,02 М, доводят рН до 7,8 и осторожно наносят на колонку. Устанавливают скорость тока жидкости 0,2—0,5 мл/мин на 1 см2 поверхности геля. Колонку трижды промывают 2 мл 0,02 М забуференного раствора NaCl, не содержащего мочевину. Затем вносят 5 мл стартового буфера и присоединяют колонку к системе для градиентной элюции (см. с. 104). В сосуд 2 наливают 250 мл стартового буфера, в сосуд 1 — 250 мл 0,3 М NaCl. Собирают фракции по 5 мл и определяют в них оптическую плотность при 260 нм. Строят профиль элюции.

ЛИТЕРАТУРА

1. Шапот В. С. и др. Методы выделения и определения активности нуклеаз//Со-временные методы в биохимии/Под ред. В. Н. Ореховича. М., 1964. Т. 1. С. 267.

2. Методы исследования нуклеиновых кислот/Под ред. А. Н. Белозерского. М., 1970.

3. Маниатис М. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., 1984.

4. Murray К., Murray N. Е. Phage lambda receptor chromosomes for DNA fragments made with restriction endonucleases III of Haemophilus influenzae and restriction endonuclease I from Escherichia coli/fi. Mol. Biol. 1975. Vol. 98. P. 551.

5. Methods in Enzymol. Part 1 (L. Grossman, K. Moldave, eds). N. Y., 1980. Vol. 65.

V. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИУКЛЕОТИДНОГО СОСТАВА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1. НУКЛЕОТИДНЫЙ СОСТАВ ДНК

Нуклеотидный состав ДНК может быть определен в результате расщепления высокополимерной молекулы соответствующими ДНКазами до мононуклеотидов Кислотный гидролиз приводит к расщеплению ДНК до свободных азотистых оснований. Последние могут быть идентифицированы методами хроматографии и электрофореза.

Кислотный гидролиз ДНК

Реактивы:

1. HCIO4 —70%- или 57%-ный раствор.

2. НС1 — концентрированная.

3. КОН — 4 М и 1 М растворы.

4. Спирт этиловый.

Препараты ДНК, полученные из различных тканей животных, дважды промывают этанолом и высушивают в вакуум-эксикаторе. Высушенные осадки смачивают 1—2 каплями концентрированной HCIO4 и гидролизуют в запаянных ампулах в кипящей водяной бане в течение 1 ч28. Препараты ДНК, полученные по методу Мармура, берут для гидролиза в количестве 5—10 мг. После вскрытия ампул гидролизаты переносят капилляром в центрифужные пробирки, добавляют к ним 2 капли 4 М КОН и осторожно, по каплям—1 М КОН до нейтральной реакции. После этого добавляют капилляром 1 каплю концентрированной НС1 и t центрифугируют 10 мин при 3000 g. Объем надосадочной жидкости доводят водой до 1 мл и подвергают хромато-графическому анализу.

РАЗДЕЛЕНИЕ ОСНОВАНИИ ДНК МЕТОДОМ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ

Реактивы:

1. Бумага хроматографическая — ватман № 1, FN 14—17, ленинградская 29.

2. НС1 — 0,1 н. раствор.

3. Щелочной растворитель — «-бутанол—Н20—концентрированный NH4OH в соотношении 60 : 10 : 0,1.

4. Кислый растворитель — изопропанол

страница 90
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
сиреневый букет невесты фото
интернет магазин в москве контейнеры для жестких линз
журнальный стол деревянный недорогой
Набор детских столовых приборов Бино 4

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)