химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

оводят при 4°С. Элек-трофоретическое разделение проводят в течение 3,5—4 ч (4—5 В/см для пластин геля или 5 мА на трубку).

Обработку электрофореграмм см. выше.

ЛИТЕРАТУРА

1. Методы исследования нуклеиновых кислот/Под ред. А. Н. Белозерского. М., 1970.

2. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М„ 1981.

3. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М., 1982.

4. О с т е р м а н Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М., 1985.

IV. ФЕРМЕНТАТИВНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Расщепление нуклеиновых кислот под вльянием специфических ферментов — эндо- и экзонуклеаз — сопровождается разрывом фосфо-диэфирной связи и образованием продуктов различной величины, которые могут быть разделены методами электрофореза и хроматографии. Это широко используется при анализе последовательности нуклеотидов в молекулах РНК и ДНК.. Особое значение при развитии генной инженерии получило расщепление ДНК специфическими эндо-нуклеазами (рестриктазами), позволяющее получать отрезки ДНК определенной длины и иуклеотидного состава. >

1. ПОЛУЧЕНИЕ РЕСТРИКТОВ ДНК ФАГА Я И РАЗДЕЛЕНИЕ ИХ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ГЕЛЕ АГАРОЗЫ

При полном расщеплении ДНК фага X рестриктазой Hind III образуются фрагменты, содержащие 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 и 165 пар оснований; они могут быть разделены с помощью электрофореза в геле агарозы.

Реактивы:

1. Трис-HCl буфер — 0,01 М раствор, рН 7,5, содержащий 0,01 MgCl2 и 0,01 М р-меркаптоэтанол.

2. Глицерин — 50%-ный раствор, содержащий 0,05 М ЭДТА, 0,25%-ный бромфеноловый синий и 0,25%-ный ксиленцианол.

3. Агароза (используют препараты с низкой величиной электроэн-доосмоса).

4. Электродный буфер—0,04 М трис-HCl буфер, рН 7,5, содержащий 0,02 М ацетат натрия и 0,0Q2 М ЭДТА.

5. Бромистый этидий — 3 мг в 1 мл НгО.

Внимание! Бромистый этидий ядовит, поэтому все операции следует проводить в резиновых перчатках!

Получение рестриктов ДНК фага X. 2 мкг ДНК фага % растворяют в 20 мкл раствора № 1, добавляют рестриктазу Hind III (2— 4 ед. ферментативной активности) и инкубируют в течение 60 мин при 37°С. Затем смесь прогревают при 70°С в течение 10 мин и охлаждают во льду. К образцу добавляют 5 мкл глицерина (раствор № 2) и подвергают электрофоретическому разделению в 1%-ном геле агарозы.

Приготовление геля. Взвешивают агарозу (250 мг) и добавляют к ней 25 мл электродного буфера. Суспензию нагревают на кипящей водяной бане до получения прозрачного раствора, не содержащего пузырьков воздуха. Охлаждают агарозу до 40°С и осторожно заливают в предварительно прогретую кассету прибора для электрофореза (с. 97). Оставляют при комнатной температуре на 1—2 ч для полимеризации.

Проведение электрофореза. Наносят в лунки геля смесь рестриктов ДНК фага % и анализируемый образец ДНК (0,05—5 мкг в зависимости от гомогенности образца). Электрофорез проводят в течение 3—4 ч при напряженности электрического поля 4—5 В/см (можно уменьшить напряжение до 1—2 В/см и проводить электрофорез в течение 10—12 ч). За движением образца следят по перемещению бромд — — — —— — — 5 *F» * ir" ^ * I"* » * S * v *?* *-* uuu IT*

леннее. После окончания электрофореза гель окрашивают в растворе бромистого этидия в течение 20—40 мин в темноте. Гель промывают водой и просматривают в ультрахемископе. Зоны, содержащие ДНК, выявляются в виде красновато-оранжевых полос на темном фоне.

Интенсивность окраски бромистым этидием зависит от размеров1 рестриктов: зоны крупных рестриктов удается выявить при наличии 30—50 нг в полосе. Для выявления мелких рестриктов необходимо иметь 200—500 нг фрагмента ДНК в каждой полосе. Поэтому для обнаружения всех фрагментов, образующихся при обработке ДНК фага Я, рестриктазой Hind III, необходимо наносить на гель образцы с минимальным (0,3—0,5 мкг) и максимальным (2—5 мкг) количеством ДНК. В последнем случае удается выявить все зоны рестриктов, при этом полосы крупных рестриктов выявляются в виде сильно перегруженных зон, а полосы средних и мелких по размеру рестриктов — в виде тонких, четко разделенных полос.

Измерив подвижность всех рестриктов ДНК, строят график зависимости относительной подвижности от логарифма молекулярной массы.

2. РАСЩЕПЛЕНИЕ РНК ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ РИБОНУКЛЕАЗОИ

И РАЗДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

РНКаза поджелудочной железы гидролизует фосфодиэфирные связи внутри молекулы одноцепочечной высокополимерной РНК. В результате образуется смесь олиго-, ди- и мононуклеотидов, которые могут быть отделены от фермента и субстрата — высокополимерной РНК — гель-хроматографией на колонке. Разделение рибонуклеотидов, различающихся по числу нуклеотидных звеньев, может быть проведено методом ионообменной хроматографии.

ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЯ НА КОЛОНКЕ С СЕФАДЕКСОМ

Реактивы:

1. Натрий-ацетатный буфер — 0,1 М раствор, рН 5,0.

2. Раствор РНК — 0,5%-ный, готовят на рас

страница 89
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы по программированию и созданию сайтов москва
ophthalmix colors доставка бесплатно
вечерние курсы дизайна
обучение кадровому производству челябинск

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)