химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ирования пробирки извлекают из ротора и раскапывают их на фракции по 3—5 капель, либо прокалывая их снизу иглой от шприца, либо опуская на дно пробирки тонкий капилляр, который присоединяют к перистальтическому насосу. Фракции собирают при помощи коллектора. К каждой фракции добавляют 2— 3 мл буфера и определяют поглощение на спектрофотометре. Строят график зависимости оптической плотности от номера фракции.

В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Методы электрофоретического разделения в полиакриламидном и агарозополиакриламидном гелях широко используются в настоящее время для фракционирования нуклеиновых кислот. Преимуществом этих методов является их простота и возможность контролировать величину пор геля. При наличии маркёров с известной молекулярной массой или коэффициентом седиментации очи могут быть использованы для характеристики относительной молекулярной массы выделенных препаратов нуклеиновых кислот.

РАЗДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ ФРАКЦИИ РНК

Реактивы:

1. Трис-ацетатный буфер — 0,12 М раствор, рН 7,8 (0,12 моль трис, 0,06 моль ацетата натрия, 0,003 моль ЭДТА растворяют в прокипяченной воде, добавляют концентрированной СН3СООН до рН 7,8 и доводят объем до 1 л).

2. Акриламид.

Внимание! Работу с акриламидом проводить в перчатках и под тягой!

3. Метиленбисакриламид.

4. Персульфат аммония — 0,5%-ный раствор, свежеприготовленный.

5. Бромфеноловый синий — 0,1%-ный раствор.

6. ТЕМЕД.

7. СНзСООН —7%-ный раствор.

8. Метиленовый синий — 0,2%-ный раствор в 0,4 М натрий-ацетатном буфере.

9. Сахароза — 40%-ный раствор.

Приготовление геля. Фракционирование РНК проводят в 2,2%-ном полиакриламидном геле (поскольку полиакриламидный гель данной концентрации имеет полужидкую консистенцию, рекомендуется сначала сделать «пробку» из геля более высокой концентрации или 1%-ной агарозы; трубки можно закрыть снизу целлофановой пленкой). К смеси 2,2 г акриламида и 0,12 г метиленбисакриламида добавляют 33 мл трис-ацетатного буфера рН 7,8, 50 мл прокипяченной Н20, 0,075 мл ТЕМЕД, 16 мл 0,5%-ного раствора персульфата аммония. Смесь осторожно перемешивают и заливают для полимеризации в кассету или трубочки электрофоретической камеры (с. 94). Сверху наслаивают трис-ацетатный буфер, разведенный в 3 раза (электродный буфер).

Проведение электрофореза. После окончания полимеризации буфер с поверхности геля отсасывают и наносят образцы РНК, полученные одним из описанных выше методов, в объеме 0,01—0,05 мл. Раствор РНК разводят электродным буфером до концентрации 2 мг/мл и добавляют равный объем 40%-ного раствора сахарозы. В электродные камеры заливают трис-ацетатный буфер (рН 7,8), разведенный в 3 раза. Для предотвращения денатурационных изменений РНК разделение рекомендуется проводить при 4°С.

Электрофоретическое разделение проводят в течение 60—90 мин при напряженности электрического поля 4—5 В/см или силе тока 5 мА на трубку. В качестве лидирующего красителя используют расidvsjj uj/umi^cnwiwDut u winci vj. ww^ic иьипчапил o.ucj\ ijjuipupcjd I ели ВЫнимают, фиксируют в течение 30 мин в 7%-иом растворе уксусной кислоты и окрашивают 0,2%-ным раствором метиленового синего в течение 4 ч. Избыток красителя отмывают 7%-ной СНзСООН. Полученные электрофореграммы сканируют и определяют процентное содержание каждой фракции. Если в том же опыте изучается электрофоретическая подвижность РНК-маркёров (рибосомальная РНК печени крысы, РНК из Esherichia coli и др.), можно определить коэффициент седиментации и относительную молекулярную массу отдельных фракций РНКРАЗДЕЛЕНИЕ РИБОСОМАЛЬНОИ РНК Реактивы:

1. Трис-ацетатный буфер — 0,4 М раствор, рН 7,6: 0,2 моль трис„ 0,1 моль ацетата натрия и 0,01 моль ЭДТА растворяют в прокипяченной воде, добавляют концентрированной СН3СООН да рН 7,6 и доводят водой до 500 мл.

2. Агароза—1%-ный раствор.

3. Акриламид—15%-ный раствор, содержащий 0,75% метиленби-сакр ил амида.

Внимание! Работу с акриламидом проводить в перчатках и под тягой!

4. ТЕМЕД.

5. Персульфат аммония—10%-ный раствор.

6. Электродный буфер — раствор № 1 разводят в 10 раз.

7. Бромфеноловый синий — 0,1%-ный раствор.

8. СНзСООН —7%-ный раствор.

9. Метиленовый синий — 0,2%-ный раствор в 0,4 М натрий-ацетатном буфере, рН 4,7.

Приготовление агарозополиакриламидного геля. Смешивают 4 мл раствора № 1, 7,0 Мл раствора № 3, 5 мл прокипяченной Н50 и 0,04 мл ТЕМЕД. Расплавляют на кипящей водяной бане 20 мл 1%-ного раствора агарозы (следят, чтобы в растворе не осталось пузырьков воздуха), охлаждают до 50°С и добавляют 4 мл 1%-ного раствора персульфата аммония. Оба раствора быстро смешивают и заливают в предварительно прогретые трубки (или кассету) электрофорети-ческой камеры (с. 95). Полимеризация протекает при комнатной температуре в течение часа.

Проведение электрофореза. Поверхность гелей промывают охлажденным электродным буфером и наносят по 10—50 мкг РНК в 0,02— 0,05 мл электродного буфера, содержащего 10%-ную сахарозу и 0,02%-ный бромфеноловый синий. Для предотвращения денатурациои-ных изменений рибосомной РНК электрофорез пр

страница 88
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
напружная реклама москва
Биотуалет WEEKEND 7011 серый с вентилятором
киркоров нижний новгород купить билет на концерт
69 фз от 21 04 2011

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)