химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

нему снова фенол (1/2 объема). После интенсивного встряхивания и центрифугирования водный слой переносят в делительную воронку и добавляют равный объем смеси хлороформа с эфиром 1 : 1 После встряхивания и отстаивания собирают водный слой и осаждают из него РНК, приливая в тройной объем охлажденного этилового спирта. Раствор оставляют на несколько часов при —20°С. Осадок рибосомной РНК собирают центрифугированием на холоде (3000 gt 20 мин), растворяют в небольшом объеме ацетатного буфера и повторяют осаждение спиртом. Осадок рибосомной РНК после центрифугирования высушивают или хранят в этаноле при —20°С.

ЛИТЕРАТУРА

1. Химия и биохимия нуклеиновых кислот/Под ред. И Б. Збарского, С. С. Дебова. Л, 1968.

2. Георгиев Г. И Быстрый метод получения дезоксирибонуклеиновых кислот в высолополимерном состоянии//Биохимия. 1959 Т. 24. № 3. С. 472.

3 Marmur J. A procedure for the isolation of DNA from microorganisms//J Mol.

Biol 1961. Vol. 3, N 2. P. 208. 4. К i r b у К. S. Isolation and characterization of ribosomal ribonucleic acid//Biochem.

J. 1965. Vol. 96. P. 266.

III. МЕТОДЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-Ю4—1-Ю10 Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области рН. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электро-форетическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от рН, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов.

1. АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ НА ГИДРОКСИЛАПАТИТЕ

Разделение различных фракций РНК, ДНК и их гибридов основано на различии в прочности сорбции одно- и двухнитевых молекул нуклеиновых кислот; прочность сорбции фрагментов нуклеиновых кислот повышается с увеличением их длины. Десорбция вызывается увеличением концентрации фосфатного буфера.

Реактивы:

1. Суспензия гидроксилапатита (коммерческий препарат или синтезированный в лаборатории по методике, описанной на с. 114).

2. Калий-фосфатный буфер —0,4 М и 0,03 М растворы, рН 7,2.

3. Препарат ДНК, РНК (или их смеси), полученный одним из описанных выше способов.

Колонку (2X15 см) заполняют густой суспензией гидроксилапатита так, как это описано на с. 102. Колонку промывают 100 мл 0,03 М фосфатного буфера. Затем в нее вносят препарат нуклеиновой кислоты из расчета 0,2 мг на 1 мл суспензии (сухие препараты растворяют в 0,03 М калий-фосфатном буфере, менее очищенные препараты предварительно освобождают от избытка ионов). Устанавливают скорость тока жидкости 0,2 мл/мин*см2. Колонку промывают 50—100 мл исходного буфера и проводят элюцию в линейном градиенте концентрации фосфатного буфера 0,03—0,4 М. Общий объем элюента —400 мл. Собирают фракции по 5—10 мл. Содержание нуклеиновых кислот определяют по поглощению при 260 нм. Порядок элюции нуклеиновых кислот с колонки гидроксилапатита при постепенном увеличении концентрации фосфатного буфера следующий: РНК, однонитевая ДНК, двух-нитевая нативная ДНК.

2. УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ РИБОНУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ САХАРОЗЫ

Фракционирование белков, нуклеиновых кислот и других макромолекул при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы основано на различии в скорости седиментации молекул, пропорциональной их молекулярной массе. Фракции РНК, обладающие различной молекулярной массой, после центрифугирования распределяются в линейном градиенте концентрации сахарозы; при этом благодаря значительной вязкости растворов сахарозы улучшается разделение и уменьшается возможность смешивания различных фракций.

Реактивы:

1. Натрий-ацетатный буфер — 0,1 М раствор, рН 5,1, содержит 0,05 М NaCl, 0,001 М ЭДТА и 0,01%-ный ДСН.

2. Сахароза — 20 и 5%-ный растворы, готовят на первом реактиве.

Линейный градиент сахарозы 5—20% создают с помощью специального прибора-смесителя, аналогичного изображенному на рис. 14, Л. Готовят одновременно 3 или 6 пробирок по 5 мл и оставляют в холодильнике. Образцы РНК растворяют в Na-ацетатном буфере в концентрации 1—2 мг/мл. Очень медленно и осторожно наслаивают по 0,1— 0,2 мл каждого образца на поверхность градиента сахарозы. Пробирки осторожно переносят в бакет-ротор SW-50 или SW-65 Ti. Ультра-центрифугирование проводят в течение 15—16 ч при 23000 g -или 6 ч при 140000 g. После центрифуг

страница 87
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
колонки на мероприятие
Фирма Ренессанс: лестница в доме на второй этаж цена - надежно и доступно!
кресло для посетителей ch 993 low v
где оставить вещи на хранение

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)