химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

о 100 мл NaCl, центрифугируют и водный слой объединяют с полученным ранее.

ДНК из объединенного водного раствора выделяют осаждением этанолом (2—2,5 объема, до исчезновения опалесценции раствора). ДНК выпадает в виде нитей. Для дальнейшей очистки ДНК переосаждают спиртом из 0,14 М NaCl. Для этого нити ДНК наматывают на палочку, подсушивают фильтровальной бумагой и переносят в раствор NaCl. После растворения ДНК вновь осаждают 2—2,5 объемами этанола, выдерживают в холодильнике в течение 1 ч и центрифугируют на холоде. Осадок промывают спиртом, эфиром и высушивают в вакуум-эксикаторе ДНК можно хранить непродолжительное время в солевом растворе (с добавлением нескольких капель толуола).

Определение чистоты выделенных препаратов РНК и ДНК проводят сгтектрофотометрически, по содержанию фосфора и пентоз (с. 162).

3. ВЫДЕЛЕНИЕ ПРЕПАРАТА РНК ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ ФЕНОЛЬНЫМ МЕТОДОМ (ПО ШЕРРЕРУ)

При обработке гомогенатов печени водонасыщенным фенолом РНК переходит в водную фазу. Выход повышается в присутствии до-децилсульфата натрия, который является также ингибитором рибонук-леаз. Для предотвращения экстракции ДНК обработку фенолом рекомендуется проводить при рН 6,0 и 60°С.

Реактивы:

1. Натрий-ацетатный буфер — 0,01 М раствор, содержащий 0,5%-ный ДСН, рН 5,1.

2. Фенол — перегнанный, водонасыщенный, рН 6,0 (приготовление см. на с. 168).

3. Спирт этиловый.

4. HCIO4— 1 н. раствор.

Крысу декапитируют, быстро извлекают печень (см. сноску к с. 167) и отмывают ее от крови охлажденным буфером. Ткань измельчают (с. 49), взвешивают и гомогенизируют на холоде с 8-кратным объемом ацетатного буфера. К вязкой суспензии добавляют равный объем фенола, закрывают колбу притертой пробкой и встряхивают в бане при 60°С в течение 5 мин. После этого колбу помещают в сосуд со льдом. Холодную смесь переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют при 600 g на холоде в течение 30 мин. Смесь разделяется на три слоя: водный, промежуточный и фенольный. Водный слой отсасывают с помощью шприца в чистую колбу, а промежуточный и фенольный слои отбрасывают. К водному слою добавляют равный объем фенола и повторяют встряхивание. После центрифугирования водный слой отсасывают, добавляют к нему тройной объем этанола для осаждения РНК и оставляют при 0°С на ночь.

Осадок РНК отделяют центрифугированием на холоде (3000 g, 10 мин). Осадок растворяют в небольшом объеме ацетатного буфера и снова осаждают РНК тройным объемом охлажденного спирта. Оставляют на ночь при 0°С или на 2 ч при —10°С. Выпавший осадок отделяют центрифугированием и растворяют в небольшом объеме ацетатного буфера. Хранят в замороженном состоянии или в холодильнике с добавлением толуола.

В полученном растворе определяют содержание РНК: ОД—0,2 мл раствора РНК доводят водой до 1,5 мл, добавляют равный объем 1 н. раствора НС104 и гидролизуют в кипящей водяной бане в течение 30 мин. Содержание РНК определяют спектрофотометрически и по реакции с орцином (с. 162, 164).

4. ВЫДЕЛЕНИЕ РНК ИЗ РИБОСОМ

Рибосомы получают из гомогената печени крысы (см. сноску к с. 167) методом дифференциального ультрацентрифугирования. Обломки клеток, ядра и митохондрии удаляют центрифугированием при 18 000 g; рибосомы осаждают ультрацентрифугированием при 105000 g.

Экстракцию РНК из рибосом проводят методом фенольной депро-теинизации. Процедуру выделения рекомендуется проводить в присутствии ингибиторов РНКаз, поскольку высокополимерные рибосомные РНК могут подвергаться расщеплению нуклеазами.

Реактивы:

1. Трис-HCl буфер — 0,1 М раствор, рН 7,6.

2. MgCl2 —0,1 М раствор.

3. Сахароза.

4. КС1 х. ч.

5. Фенол — перегнанный, водонасыщенный, рН 6,5 (приготовление см. на с. 168).

6. Хлороформ.

7. Эфир.

8. Спирт этиловый.

9. Гепарин.

10. Натрий-ацетатный буфер — 0,1 М раствор, рН 5,0

Получение рибосом из печени крысы. Навеску ткани гомогенизируют (приготовление препарата см. на с. 49) в гомогенизаторе Пот-тера в 5-кратном объеме среды выделения следующего состава: 0,01 М трис-буфер (рН 7,6), 0,02 М MgCl2 и 0,05 М сахароза. Гомогенат центрифугируют на холоде при 18 000 g в течение 30 мин. Центрифугат сливают в колбу, осадок суспендируют в таком же объеме среды выделения и повторяют гомогенизацию. Гомогенат центрифугируют, осадок отбрасывают, а центрифугат объединяют с первым. Объединенный раствор подвергают ультрацентрифугированию при 105 000 g в течение 90 мин. Осадок рибосом суспендируют в среде, содержащей 0,1 М трис-буфер и 0,001 М MgCl2. Если суспензия мутная, ее осветляют центрифугированием на холоде (18 000 g, 15 мин). Очистка фракции рибосом может быть проведена также ультрацентрифугированием в градиенте концентрации сахарозы 10—30% (с- 172).

Экстракция РНК. К суспензии рибосом добавляют ингибитор РНКаз гепарин (можно использовать также диэтилпирокарбонат, по-ливинилсульфат) из расчета 0,5 мг на 1 мл и равный объем фенола. Смесь встряхивают 30 мин и центрифугируют на холоде 30 мин при 600—1000 g. При помощи шприца отбирают верхний водный * слой и добавляют к

страница 86
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
крепеж для проектора потолочный
функции пульта смарт баланс
квп-мс 500х250
необычные полки на стену

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.10.2017)