химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ралевидные образования — нуклеиновые кислоты. Для более полного осаждения раствор переливают из стакана в стакан. Спиралевидные нити осторожно переносят палочкой в стакан с небольшим количеством 70%-ного этилового спирта, повторяя операцию 2—3 раза с новыми порциями спирта. Затем нуклеиновые кислоты промывают сначала смесью спирт—эфир (1:1), затем эфиром и оставляют сушиться при комнатной температуре.

Разделение ДНК и РНК- Сухой препарат нуклеиновых кислот растворяют в 0,5 н. NaOH из расчета 2—3 мг/мл и выдерживают 15 мин в кипящей водяной бане. Раствор охлаждают и нейтрализуют на холоде, добавляя по каплям при помешивании концентрированную НСЮ4, затем доводят концентрацию НСЮ4 до 2%. Выпавший осадок ДНК отделяют на центрифуге с охлаждением (3000 g, 10 мин). Осадок промывают дважды холодным раствором 2%-ной НС104 и дважды 70%-ным спиртом, затем смесью спирт—эфир и эфиром (осадок каждый раз собирают центрифугированием). Осадок ДНК высушивают на воздухе и анализируют.

2. ВЫДЕЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДНК И РНК ФЕНОЛЬНЫМ МЕТОДОМ (ПО КИРБИ—ГЕОРГИЕВУ)

27 Здесь и в других задачах при выделении ДНК из печени животное рекомендуется не кормить в течение суток.

Метод предполагает получение высокополимерных ДНК и РНК, свободных от белков. Под действием водонасыщенного фенола на ну-клеопротеиды осуществляется их депротеинизация, причем при различных значениях рН для дезокси- и рибонуклеопротеидов. Обработка фенолом инактивирует нуклеазы, что позволяет получать нуклеиновые кислоты в нативном состоянии.

Реактивы.

1. Фенол — перегнанный, водонасыщенный, рН 6,0 и 8,3.

Фенол перегоняют на песчаной или масляной бане. В колбу Вюрца помещают 88 г фенола, 12 мл Н20, 100 мг алюминиевых стружек и 50 мг iNaHC03 Собирают фракцию, кипящую при 183°С. При хранении в холодильнике фенол длительное время не подвергается окислению. Перегнанный фенол помещают в делительную воронку, приливают равный объем воды, тщательно встряхивают и оставляют на несколько часов. После расслоения жидкостей слой фенола осторожно сливают в сухую склянку. Фенол нейтрализуют NaOH.

2. NaCl —0,14 М раствор, содержащий 0,05 М цитрат калия.

3. Спирт этиловый абсолютный.

4. Эфир, содержащий 6—7 капель ледяной уксусной кислоты на 100 мл.

Все операции следует проводить на холоде. Около 20 г ткани (печень, мозг, селезенка, см. сноску на с. 167), взятой после де-капитации (с. 221), измельчают ножницами и гомогенизируют (или растирают) в 10-кратном объеме 0,14 М NaCl (п. 2). Полученный гомогенат фильтруют через 1—2 слоя марли. К фильтрату добавляют равный объем фенола рН 6,0. Смесь интенсивно встряхивают в колбе с притертой пробкой или делительной воронке в течение 40 мин и центрифугируют на холоде (600g, 30 мин). Содержимое пробирки (стакана) разделяется на 3 слоя. Верхний (водный), содержащий депротеинизирован-ную РНК, осторожно отсасывают при помощи шприца в чистую колбу и сохраняют. Средний слой, непрозрачный, вязкий, содержащий дезоксирибонуклеопротеиды и нерастворимые в феноле белки, подвергают вторичной обработке (фенолом. Третий — прозрачный фенольный слой, содержащий растворимые в феноле белки, отбрасывают. При повторной обработке к среднему слою добавляют 5-кратный (по отношению к навеске ткани) объем фенола и хлористого натрия. Смесь интенсивно встряхивают и центрифугируют. Верхний водный слой осторожно отсасывают и соединяют с первым. Промежуточный отсасывают и используют для получения ДНК. Фенольный слой отбрасывают.

Выделение РНК. К водному раствору, содержащему РНК, добавляют для дополнительной депротеинизации фенол рН 6,0 (1/2 объема) , интенсивно встряхивают 20 мин и центрифугируют на холоде (600 g, 30 мин). Верхний слой отсасывают и для осаждения РНК приливают в стакан с тройным объемом хорошо охлажденного этанола и оставляют в холодильнике на 1 ч (не рекомендуется в этой стадии оставлять на более длительное время, так как возможна денатурация РНК)- Выпавший осадок РНК собирают центрифугированием на холоде (3000 g, 10 мин) и затем растворяют в небольшом количестве воды. Нерастворившийся осадок удаляют центрифугированием и отбрасывают. Препарат разливают на порции и хранят в замороженном состоянии или в холодильнике с добавлением нескольких капель толуола. Полученный препарат РНК содержит высоко- и низкополимерную фракции.

Выделение ДНК. К промежуточному слою, полученному после повторной обработки фенолом (рН 6,0), добавляют водонасыщенный фенол (рН 8,3) в количестве, равном первоначально взятому (из расче1 со

та 10 мл на 1 г навески ткани), встряхивают несколько минут, добавляют равный объем воды и перемешивают 30—40 мин не очень интенсивно (круговыми движениями). При этом происходит депротеиниза-ция и ДНК переходит в водную фазу. На этой стадии препарат может быть оставлен на ночь в холодильнике. Затем смесь центрифугируют на холоде (600 g, 30 мин). В центрифугате образуются три слоя. Верхний, водный слой, содержащий ДНК, осторожно отсасывают с помощью шприца; промежуточный и фенольный слои встряхивают повторно с

страница 85
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
В магазине КНС Нева роутер Ubiquiti купить - от товаров до интеграции в Санкт-Петербурге!
umbro в рязани купить
Rhythm LCD Clocks LCT063NR08
чистка домашнего кондиционера цена

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.02.2017)