химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

энзиматической и кислотной деструкции нуклеиновых кислот.

К высушенному материалу добавляют и,(Ь н. раствор КОН (из расчета 1 мл щелочи на 100 мг сухого материала) и проводят гидролиз при 37°С в течение 18 ч (или 5 мин при кипячении). После гидролиза суспензию охлаждают до 0°С и нейтрализуют по лакмусу хлорной кислотой. К нейтрализованной смеси добавляют концентрированную НС104 до конечной концентрации 1—2% и после интенсивного перемешивания смесь центрифугируют на холоде при 5000 g в течение 15 мин. После отделения супернатанта, содержащего рибомононуклео-тиды, осадок дважды промывают 1 мл 2%-ного раствора HCIO4. Цен-трифугаты объединяют, нейтрализуют 40%-ным раствором КОН по бромфеноловому синему и оставляют в холодильнике на 1—3 ч; выпавший осадок КСЮ4 отделяют центрифугированием и отбрасывают, центрифугат используют для определения общего содержания рибонуклеиновых кислот спектрофотометрически (с. 162) или по цветной реакции на рибозу (с. 164), а также для определения нуклеотидного состава (с. 180).

Определение ДНК

Выделение препаратов ДНК с использованием метода Шмидта— Таннгаузера и освобождение их от белков могут быть проведены различными способами. В модификации, предложенной А С Орловым и Е. И Орловой, щелочной гидролиз тканевых препаратов проводят без предварительного выделения нуклеиновых кислот и удаления свободных нуклеотидов. ДНК отделяют от белков и осаждают спиртом.

Реактивы:

1. NaOH—1 н. раствор.

2. NaCl — насыщенный раствор в 20%-ном растворе СН3СООН.

3. НСЮ4 — 0,5 н. раствор.

4. Этиловый спирт.

50—100 мг ткани помещают в центрифужную пробирку, добавляют

1 мл 1 н. раствора едкого натра и при помешивании нагревают в кипящей водяной бане в течение 5 мин (нагревание можно заменить инкубацией при 37°С в течение 18 ч). Прозрачный, слегка опалесцирую-щий гидролизат охлаждают до комнатной температуры и погружают в сосуд с тающим льдом. Добавляют 0,5 мл насыщенного раствора хлористого натрия, приготовленного на 20%-ном растворе уксусной кислоты. Через 3—5 мин выпавший в осадок белок отделяют центрифугированием (4°С, 600 g, 10 мин). Центрифугат сливают в стакан, осадок белка растворяют на холоде в 1 мл 1 н. раствора щелочи и белки вновь осаждают добавлением 0,5 мл NaCl. Раствор центрифугируют. Центрифугаты объединяют и для осаждения ДНК приливают в стакан с тройным объемом охлажденного этанола. Раствор оставляют на 1—2 ч в холодильнике и осадок ДНК собирают центрифугированием на холоде (600 g, 10 мин). К осадку добавляют 5 мл 0,5 н. раствора HCIO4, закрывают пробками с воздушными холодильниками и помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. В гидролизате определяют содержание ДНК спектрофотометрически (с. 162) и по реакции с дифениламином (с. 163).

ЛИТЕРАТУРА 1. Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кислот. М, 1976.

2 Спирин А С Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот//Биохимия. 1958. Т. 23, № 4. С. 656.

3. Орлов А. С, Орлова Е. И. Простая методика количественного определения дезоксирибонуклеиновой кислоты в животных тканях//Биохимия 1961 Т. 26, № 5„ С. 834

II. ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ДНК ПО МЕТОДУ МАРМУРА

Данный метод является одной из модификаций метода Шмидта и Таннгаузера. Разделение РНК и ДНК в результате щелочного гидролиза осуществляется после предварительного выделения нуклеиновых кислот из биологического материала.

Реактивы:

1. Солевой раствор: 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат натрия, 0,01 М ЭДТА. Навеску ЭДТА растворяют в воде, доводят рН раствора до 8,0 и затем добавляют остальные компоненты.

2. Додецилсульфат натрия — 20%-ный раствор.

3. NaCl — 5 М раствор.

4. Хлороформ.

5. Изоамиловый спирт. , 6. Этиловый спирт.

7. Эфир этиловый.

8. INAOH —0,5 н. раствор.

9. НСЮ4 — концентрированная и 2%-ный раствор.

Выделение нуклеиновых кислот. 20 г ткани27 гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе или растирают в ступке с 5-кратным объемом солевого раствора. К гомогенату добавляют 20%-ный раствор ДСН до конечной концентрации 2% и выдерживают 30 мин в термостате при 37°С. К образовавшемуся вязкому раствору добавляют 5 М NaCl до концентрации 1 М для диссоциации нуклеопротеидного комплекса. Гомогенат переносят в колбу с притертой пробкой и тщательно встряхивают в течение 10—15 мин с 2,5 объемами смеси хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 24:1. Смесь переносят в стеклянные центрифужные стаканы на 50 мл, центрифугируют 30 мин при 800—1000 g. Надосадочная жидкость расслаивается на три фракции: в верхней содержатся нуклеиновые кислоты, в средней (плотной) — белки, в нижней, хлороформной фракции — липиды и другие компоненты.

Верхнюю фракцию осторожно отсасывают с помощью шприца з колбу. Повторяют обработку хлороформом и изоамиловым спиртом еще 2—3 раза, пока раствор нуклеиновых кислот не станет прозрачным. Полученный раствор отсасывают и медленно выливают в стакан с двойным объемом охлажденного 96%-ного этилового спирта, помешивая при этом спирт круговыми движениями. Выпадают белые спи

страница 84
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
юрист по ипотеке цена
веер купить интернет магазин недорого
консоль под телевизор купить
дачные умывальники с подогревом купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(04.12.2016)