химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ные реактивы те же, что на с. 158.

В кювету спектрофотометра наливают 0,1 мл ЬЮ-3 М раствора глутатиона и 2,7 мл 0,5 М КС1 (рН 7,6). В контрольную кювету — 2,8 мл 0,5 М КС1. В обе кюветы добавляют по 0,02 мл 5-10г4 М л-ХМБ, тщательно перемешивают и через 2 мин измеряют оптическую плотность при 250 нм (необходимость добавления раствора л-ХМБ в контрольную пробу вызвана сильным поглощением этого соединения при 250 нм). Затем последовательно еще 5—6 раз добавляют по 0,02 мл раствора, измеряя каждый раз (спустя несколько минут) его оптическую плотность. Объем последующих добавляемых порций п-ХМБ уменьшают до 0,01 мл. Добавление раствора продолжают до тех пор, пока не прекратится нарастание оптической плотности при внесении новых порций /г-ХМБ. Это указывает на связывание всех SH-rpynn.

Рис 24. Кривая титрования SH-rpynn глутатиона

Построив кривую зависимости АЛ2БО от объема добавленного /г-ХМБ (рис. 24), определяют его количество, соответствующее точке перегиба на кривой. Так как в точке эквивалентности связан весь добавленный /г-хлор-меркурибензоат, его количество равно количеству сульфгидрильных групп в 0,1 мл 1-10~3 М раствора глутатиона. Рассчитывают число SH-групп в пере счете на моль восстановленного глутатиона.

Определение количества сульфгидрильных групп в препарате миозина

Сульфгидрильным группам миозина принадлежит важная роль в ферментативном катализе, а также в образовании актомиозинового комплекса. По данным аминокислотного анализа, в миозине содержится 15—17 моль SH-групп на каждые 200 000 г белка (молекулярную массу миозина в настоящее время считают равной 500 000 Да). В препаратах миозина методами титрования обычно определяется 10— 12 моль SH-групп на 200 000 г белка (это количество несколько неоднозначно для разных препаратов миозина и зависит также от «возраста» белка: при хранении препаратов оно уменьшается).

Реактивы:

1 Миозин (получение см. на с. 392).

2. Реактивы для определения концентрации /г-ХМБ (с. 158).

Для определения количества SH-rpynn исходный раствор миозина разводят 0,5 М КС1 (рН 7,6) до конечной концентрации белка 0,85 мг/мл. В одну кювету спектрофотометра наливают 2,8 мл 0,5 М раствора КС1 (контрольная проба), в другую — 2,8 мл разведенного раствора миозина. Измеряют оптическую плотность при 250 нм (обычно она составляет 0,4—0,6). Затем в обе кюветы добавляют по 0,02 мл очигж ivi раствора /г-лто уточная концентрация раствора определяется, как описано на с. 158), содержимое кювет тщательно перемешивают и через 2 мин измеряют оптическую плотность. Дальнейший ход титрования аналогичен описанному выше (с. 159) для раствора глута-тиона.

Нужно иметь в виду, что в процессе титрования, когда связываются несколько менее реакционноспособные SH-группы миозина, образование меркаптидной связи замедляется. Поэтому после каждой добавленной порции л-ХМБ необходимо делать 3—4 измерения и при достижении плато перед добавлением следующей порции выжидать 5— б мин.

Построив кривую титрования (см. рис. 24) и определив точку эквивалентности, рассчитывают количество сульфгидрильных групп, соответствующее 200 ООО г белка.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА СУЛЬФЕИДРИЛЬНЫХ ГРУПП С ПОМОЩЬЮ РЕАКТИВА ЭЛЛМАНА

В основе метода лежит реакция тиол-дисульфидного обмена:

СООН

_/

S-<( )>-N02

\_/

СООН

R__SH+ ~= ->R—S—S—/ 4_N02 +

s-~N°2 <

\

СООН

+ s- -У Ч„ ш2,

—\

СООН

в ходе которой освобождается анион 2-нитро-5-тиобензоата, обладающий поглощением при 412 нм. Коэффициент молярной экстинкции 2-нитро-5-тиобензоата зависит от рН. Обычно реакцию проводят при щелочных значениях рН (рН 8,0—9,0). При этом принимают 6412=14 000. Описываемый метод высокочувствителен и строго специфичен и может использоваться для определения количества сульфгидрильных групп в низкомолекулярных тиолах, нативных и денатурированных белках.

Реактивы:

1. Фосфатный (или трис-HCl) буфер—10 мМ раствор, рН 8,0.

2. Исследуемый белок — 30—70 мкМ (по SH-группам) раствор в 10 мМ фосфатном буфере, рН 8,0, содержащем 1 мМ ЭДТА.

3. ДТНБ— 10 мМ раствор в 10 мМ фосфатном буфере, рН 8,0.

В кювету спектрофотометра вносят раствор белка и добавляют 5—10-кратный молярный избыток ДТНБ над сульфгидрильными группами. Полученную смесь перемешивают и через 5—10 мин измеряют оптическую плотность при 412 нм. Спустя 30 мин проводят повторное измерение оптической плотности, используя в качестве контроля раствор, содержащий равное количество ДТНБ, но не содержащий белка или низкомолекулярного тиола. Обычно реакция протекает очень быстро и максимальная оптическая плотность достигается через 5—

10 мин после начала реакции. Описанное определение количества сульфгидрильных групп можно проводить в присутствии денатурирующих белки агентов (6 М гуанидинхлорид или 8 М мочевина). В этих условиях происходит полная денатурация белка и удается определить суммарное количество сульфгидрильных групп, приходящихся на моль белка. Зная, что в ходе реакции модификация одной сульфгидрильной группы сопровождается освобождением о

страница 81
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
услуги по хранению вещей москва
химчистка салона автомобиля джип
курсы детского массажа в москве с сертификатом
микроавтобус с водителем на свадьбу

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)