химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ант отбрасывают, промывание водой повторяют 2—3 раза. Если препарат фермента не освобожден от примеси эндопептидаз, проводят следующую обработку. Отмытые кристаллы карбоксипептидазы А (около 400 мкг в 20 мкл) суспендируют в 0,1 мл 0,1 М раствора NaCl и на холоде при встряхивании добавляют 20 мкл 0,1 н. раствора NaOH. При этом величина рН становится равной 9,0 и кристаллы растворяются. К полученному образцу добавляют 0,4 мл 0,2 М раствора NH4HC03 (рН 8,0) и 20 мкл 2%-ного раствора диизопропилфторфосфата в изопропаноле. Диизо-пропилфторфосфат высокотоксичен и может быть заменен менее токсичным фенилметилсульфонилфторидом. Полученную смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин, охлаждают и хранят в холодильнике.

Если препарат карбоксипептидазы уже освобожден от примеси эндопептидаз, обработку диизопропилфторфосфатом следует опустить. В этом случае кристаллы карбоксипептидазы А (5 мг) суспендируют в ?,1 М растворе NaCl (4—4,5 мл) и растворяют путем осторожного добавления 0,1 н. раствора NaOH. В связи с тем что карбоксипептидазы А и В являются металлоферментами, в ряде методик рекомендуют добавлять к раствору фермента, полученному по вышеуказанному способу, 0,5 мл 0,1 н. раствора СоС12 и выдерживать раствор при 25°С в течение 10 мин. Концентрацию фермента можно определить, измерив оптическую плотность раствора при 278 нм (коэффициент молярной экстинкции 8,6-104, м.м. = 34 300). Полученный препарат фермента хранят в холодильнике.

Определение. 0,5—1 мкмоль белка растворяют в 10—20 мл воды и осаждают на холоде, добавляя трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 5%. Осадок промывают 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, а затем 3—4 раза ацетоном для удаления ее следов. Указанные стадии позволяют удалить свободные аминокислоты, которые могут загрязнять препарат белка, и приводят к денатурации белка, повышающей доступность С-концевых аминокислот к действию карбоксипептидаз. При определении С-концевых аминокислот в пептидах первые стадии необходимо опустить. Промытый осадок белка или пептид растворяют в 0,2 М аммоний-бикарбонатном буфере или в

0,05 М тризтиламмоний-бикарбонатном буфере до конечной концентрации 1—5 мг/мл и добавляют раствор карбоксипептидазы (отношение фермент : субстрат = 1 : 30—1:200). Проводят инкубацию при 37°С и отбирают аликвоты, содержащие 0,1—0,2 мкмоль белка, сразу после добавления фермента (нулевая точка), а затем через 30, 60, 120 и 420 мин после начала инкубации. Параллельно с опытной ставят контрольную пробу без белка, но содержащую все остальные компоненты реакционной смеси, включая карбоксипептидазу. Реакцию останавливают добавлением к отобранным пробам раствора уксусной кислоты до конечной концентрации 10%. Если при этом выпадает осадок, его отделяют центрифугированием и промывают 2 раза водой. Супернатант после первого центрифугирования и промывные жидкости объединяют и упаривают на роторном испарителе.

В полученных образцах определяют свободные аминокислоты. При тонкослойной хроматографии на пластинах «Фиксион» (с. 133) требуется не менее 10—30 нмоль аминокислот, для определения с помощью аминокислотного анализатора — 2—5 нмоль аминокислот. Можно предварительно провести реакцию дансилирования (с. 148), а затем идентифицировать модифицированные аминокислоты с помощью тонкослойной хроматографии (в этом случае надо иметь 0,5—5 нмоль дансили-рованных аминокислот). При количественном определении аминокислот можно исследовать зависимость освобождения их от времени инкубации образца с карбоксипептидазой.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВЫХ АМИНОКИСЛОТ С ПОМОЩЬЮ ГИДРАЗИНОЛИЗА

При обработке белка или пептида безводным гидразином при нагревании (100°С) происходит гидролиз полипептидной цепи. При этом все аминокислоты, за исключением С-концевой, превращаются в гид-разиды, а С-концевая аминокислота остается свободной:

Ri R2

H2N—СН—СО—NH—СН — СО ... NH— CH—COOH-f NH2NH2^!Ј->

Яг R2

I Iу H2N—СН—СО — NH — NH2 + H2N—СН—СО— NH—NH2 +

Rn Rif H2N-~СН —COOH *=^-> R—CH = N—CH —CO — NH—N = CH — R +

R2 R,i

I I

+R—CH = N—CH—CO—NH—N = CH—R + H2N—CH—COOH.

Гидразиды аминокислот удаляют реакцией с бензальдегидом, изо-валериановым и другими альдегидами, а находящуюся в водной фазе С-концевую аминокислоту анализируют методами хроматографии или электрофореза на бумаге и в тонком слое или с помощью аминокислотного анализатора. Смесь, получаемую после гидразинолиза, можно обрабатывать динитрофторбензолом или дансилхлоридом. Это дает возможность идентифицировать С-концевые аминокислоты в виде ДНФ- (с. 145) или ДНС-производных (с. 148).

/

Реактивы:

1. Исследуемые белки (рибонуклеаза, лизоцим и др.) или пептиды.

2. Гидразин (безводный). 50 г 80%-ного раствора гидразина смешивают с 500 мл толуола и 500 г СаО и выдерживают в течение 12 ч. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 3 ч и отгоняют при 93—94°. Нижний слой дистиллята используют как безводный гидразин.

Внимание! Гидразин взрывоопасен! Работу с ним проводят в очках под вытяжкой, с малыми количествами.

3. Бензальде

страница 79
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
скв лечится
NetGear ANT224D10-10000S
матрасы 160х200 распродажа
линзы extra green

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.08.2017)