химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

должительного (10—16 ч) времени. ДНС-аминокислоты (так же, как ДНС—ОН и ДНС—NH2) обладают интенсивной флуоресценцией (максимум возбуждения около ~370 нм), что обеспечивает высокую чувствительность описываемого метода.

Реактивы:

1. NaHC03 - 0,2 М раствор.

2. Раствор дансилхлорида в ацетоне — 2 мг/мл. Указанный раствор не следует долго хранить.

3. НС1 — 5,7 н. раствор, перегнанная (с. 124).

Реакцию проводят в маленьких пробирках (высота 40—45 мм, внутренний диаметр 3—4 мм) или в специальных пробирках, снабженных шлифом с краном. Образец пептида или белка (10—20 нмоль) вносят капилляром на дно пробирки. Содержимое пробирки высушивают в вакуум-эксикаторе. В пробирку добавляют 10—20 мкл 0,2 М раствора ЫаНСОз и снова высушивают в вакуум-эксикаторе. Цель высушивания состоит в удалении следов аммиака, мешающего проведению реакции. К высушенному образцу добавляют равные объемы (10—20 мкл) бидистиллированной воды, свободной от аммиака, и ДНС—С1 в ацетоне и инкубируют при 37 °С 30—40 мин. Об окончании реакции можно судить по исчезновению желтой окраски раствора. Образец помещают в вакуум-эксикатор и упаривают досуха. Добавляют 30—60 мкл 5,7 н. НС1, после чего пробирки без шлифов запаивают, а пробирки со шлифом и краном подключают к вакуумному насосу, вакуумируют и герметически закрывают. Образцы подвергают гидролизу при 105 °С в течение 4—18 ч. Пробирки охлаждают, вскрывают, образец высушивают досуха в вакуум-эксикаторе или на роторном испарителе. Описанная процедура разработана для пептидов и небольших белков, хорошо растворимых в воде или растворах бикарбоната натрия. Если белок не растворяется в этих условиях, дансили-рование можно проводить в 0,2 М растворе NaHC03, содержащем 0,1%-ный додецилсульфат натрия. В этом случае, однако, возникает, необходимость удаления додецилсульфат а натрия до проведения кислотного гидролиза. Этого можно достичь, осаждая дансилированный белок 2—3-кратным объемом ацетона и последующей 2—3-кратной отмывкой осадка ацетоном.

Для идентификации ДНС-аминокислот используют методы высоко- и средневольтного электрофореза на бумаге, тонкослойной хро , ..„..^^хшл vi»junui witm или пилиамиДОМ,

а также высокоэффективную жидкостную хроматографию высокого> давления (ЖХВД). В зависимости от используемого метода удается детектировать от 1 • Ю-10 моль (метод ЖХВД) до 5»10—9 моль (электрофорез на бумаге) дансилированных производных, что обеспечивает более чем 100-кратное повышение чувствительности по сравнению с определением N-концевых аминокислот методом динитрофенилирова-ния (см. выше).

На электрофореграммах и тонкослойных пластинках все ДНС— аминокислоты и ДНС—NH2 видны в виде ярко-желтых пятен, ДНС— ОН — в виде ярко-голубого пятна.

Идентификация ДНС-аминокислот с помощью электрофореза на бумаге

Реактивы:

1. Аммонийно-ацетатный буфер, рН 4,38. 32 мл ледяной уксуснойг кислоты смешивают с 1,9 л воды и доводят рН до 4,38 раствором аммиака. Объем буфера доводят до 2 л.

2. ДНС-аминокислоты-«свидетели» — 0,5—0,8 мг/мл в смеси ацетон — 1 н. НС1 в соотношении 9:1.

3. Бумага хроматографическая (ватман 1, FN 15), размер 20 X Х60 см.

а-mcip /гей сер ДНС-Ш арг гас о-тир duo-тир иле ала глй глу uuc-SQ^H

« • • • « • о

• О • *Ш • • • » • CD • • •

а-лиэ в-лиз бис-лиз (рен тре ДНС-Ш асп КМ-цис

ДИС- NH2 три бал про Mem-SQ2

+

Рис. 21. Схема расположения ДНС-аминокислот после электрофореза на бумаге

тания (1500 В, 500 мА) (см. рис. 20) и проводят электрофорез при напряжении 1500 В (напряженность 25 В/см) в течение 6—8 ч. После

Сухую бумагу размечают так, что линия старта находится на расстоянии одной трети (20 см) от катода. Гидролизат, растворенный в смеси ацетон — 1 н. HCI или в 50%-ном растворе пиридина, наносят на сухую бумагу в минимальном объеме (10—20 мкл). С обеих сторон от образца-гидролизага на расстоянии 2—3 см наносят образцы отдельных ДНС-аминокислот-«свидетелей», а также 2 стандартные смеси ДНС-аминокислот. Смесь А состоит из ДНС-производных аспа-рагиновой кислоты, пролина, треонина, валина, фенилаланйна, бис-ДНС-лизина, а-ДНС-лизина, ?-ДНС-лизина и ДНС-NHs. Смесь В состоит из ДНС-производных цистеиновой кислоты, глицина, глута-миновой кислоты, серина, аланина, лейцина, изолейцина, гистидина, аргинина, а-ДНС-тирозина, о- и бмг-ДНС-тирозина. На бумагу необходимо наносить не менее 1—5 нмоль каждой из ДНС-аминокислот. После нанесения образцов бумагу увлажняют буфером (с. 138), помещают в прибор для средневольтного электрофореза с источником пиокончания электрофореза бумагу тщательно высушивают в токе теплого воздуха, а затем в сушильном шкафу при 100 °С и просматривают под ультрахемископом. Все ДНС-аминокислоты, входящие в смеси А и Б, хорошо отделяются друг от друга. В то же время в сложных смесях плохо разделяются ДНС-аспарагиновая и ДНС-глутаминовая кислоты, группа ДНС-серин, ДНС-глицин и ДНС-аланин, группа ДНС-валин, ДНС-изолейцин, ДНС-фенилаланин, а также пары ДНС-гистидин и

страница 76
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
колонки с микрофоном аренда
Фирма Ренессанс купить лестницу лес-91 - надежно и доступно!
кресло 781
Выгодное предложение от интернет-магазина KNSneva.ru на SSDSC2BX200G401 с доставкой в пределах Петербурга

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)