химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

твором аммиака. Разделение водорастворимых ДНФ-аминокислот можно провести в системе пропанол — аммиак (7:3)23. Исследуемый гидролизат ДНФ-производного белка или пептида и растворы ДНФ-аминокислот-«свидетелей» наносят на линию старта, расположенную на расстоянии 1,5—2 см от нижнего края пластинки. Расстояние между точками — от 1 до 1,5 см. Диаметр наносимых пятен не должен превышать 2 мм. Пропускание растворителя продолжают приблизительно 50 мин (растворитель должен дойти до верхнего края пластинки). Во время хроматографирования камеру нужно закрыть черной бумагой. После высушивания пластинок на воздухе анализируемые ДНФ-аминокислоты идентифицируют путем сравнения положения их пятен с положением пятен ДНФ-амннокис-лот-«свидетелей».

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА СВОБОДНЫХ Ш2-ГРУПП В ПЕПТИДАХ (АМИНОКИСЛОТАХ) МЕТОДОМ ЧАСТИЧНОГО ДИНИТРОФЕНИЛИРОВАНИЯ

Исследуемое вещество (пептид, аминокислота, аминоуглевод) вводят в реакцию с различными количествами ДНФБ (например, на 1 эквивалент исследуемого соединения берут 1/4, 1/2, 1 и 2 эквивалента ДНФБ). В результате реакции образуются продукты различной степени замещения по аминогруппам, которые легко могут быть разделены методами электрофореза и бумажной или тонкослойной хроматографии. По числу ДНФ-производных судят о числе свободных NH2-rpynn в исследуемом соединении.

Определение числа свободных NH2-rpynn в лизине

Реактивы:

23 О других системах растворителей см.- Дэвени Т., Гергей Я- Аминокислоты, пептиды и белки. М., 1976; Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. М., 1965.

1. Лизин-НС1 — 10 мг/мл (~0,1 мэкв/мл по NH2-rpynne).

2. 2,4-Динитрофторбензол (ДНФБ) — 2%-ный ( — 0,1 мэкв/мл) раствор в этиловом спирте.

а. i рисииллтлн, UCJJCI паппсаа.

4. «-Бутиловый спирт, насыщенный 0,1%-ным раствором аммиака.

5. Нингидрин — 0,2%-ный раствор в ацетоне

б. NaHC03 — 1%-ный раствор.

В 2 пробирки вносят по 0,5 мл раствора лизина, что соответствует 0,05 мэкв. В первую пробирку добавляют 0,25 мл (0,025 мэкв), а во вторую — 1 мл (0,1 мэкв) раствора ДНФБ, в результате чего соотношение реагирующих количеств лизина и ДНФБ в 1-й пробирке соответствует 1 :0,5, а во 2-й — 1:2. В обе пробирки добавляют с помощью капилляра по одной капле триэтиламина и реакционные смеси инкубируют при 37 °С в течение 30—45 мин, периодически встряхивая. После инкубации реакционные смеси исследуют методом бумажной или тонкослойной хроматографии.

В качестве свидетелей используют свободный ДНФ, а также мо-но- и ди-ДНФ-производные лизина. Эти соединения окрашены в желтый цвет и определение их локализации на хроматограмме не требует специальной обработки. Для обнаружения свободного лизина хроматограммы обрабатывают нингидрином (с. 129). В указанных условиях хроматографирования свободный лизин располагается вблизи линии старта, далее в порядке удаления от нее следуют: моно-ДНФ-про-изводное лизина (е-ЫН2-ДНФ-лизин), имеющее после обработки нингидрином буро-коричневое окрашивание, свободный ДНФ и ди-ДНФ-производное лизина. Для количественного определения моно- и ди-ДНФ-производных лизина соответствующие участки хроматограммы вырезают, элюируют 1%-ным раствором NaHC03 и измеряют оптическую плотность элюатов при 360 нм.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ N-КОНЦЕВЫХ АМИНОКИСЛОТ ДАНСИЛЬНЫМ МЕТОДОМ

Аминогруппы белков и пептидов при щелочных значениях рН взаимодействуют с флуоресцентным красителем диметиламинонафта-ленсульфонилхлоридом (дансилхлоридом, ДНС—С1):

Н3С—N—СН3

Н3С—N—СН3

R

/\/\f- H2N—СН—СО—NH

рН9,7

I

SOaCl

\/\/ I

S02—NH—СН—СО— NH

I

R

Помимо а- и Е-аминогрупп дансилхлорид вступает в реакцию с ОН-группами тирозина, SH-группами цистеина и имидазольными кольцами гистидина (два последних соединения неустойчивы при щелочных значениях рН), а также с аммиаком, растворенным в воде. При взаимодействии ДНС—С1 с аммиаком образуется дансилсульфо-намид (ДНС—NH2). При щелочных значениях рН, дансилхлорид подвергается гидролизу с образованием дансилсульфоновой кислоты (ДНС-ОН). После окончания реакции дансилирования модифицированный белок или пептид подвергают кислотному гидролизу. БольШПП^Юи ДОШ/"»!"""^ — — ^г -,

а также ДНС—NH2 и ДНС—ОН достаточно стабильны при гидролизе в 6 н. НС1 при 105 °С в течение 4—10 ч. Однако в указанных условиях* полностью разрушается ДНС-триптофан, частично разрушаются дан-сильные производные метионина, карбоксиметилцистеина и пролина. Для надежной идентификации трех последних соединений следует уменьшать время гидролиза до 4 ч. С другой стороны, вследствие того, что пептидные связи, образованные остатками алифатических аминокислот (валина, лейцина, изолейцина), обладают большой устойчивостью к кислотному гидролизу, в ходе кратковременного гидролиза они разрываются не полностью. Это может приводить к образованию дансилированных дипептидов и усложнять интерпретацию получаемых результатов. Чтобы избежать указанных трудностей, дансилирован-ный образец белка или пептида делят на две пробы, одну из которых гидролизуют в течение короткого (4 ч), а другую — в течение про

страница 75
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
КНС - Кликните и при заказе введите промокод "Галактика" на скидку - ноутбук игровой дешево купить с доставкой по Москве и городам России.
ремонт холодильников в подольске
6.8003.19B
тейп купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(19.01.2017)