химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

F о n t a n a A., D а 1 z о р р о D., G г a n d i С. et al. Cleavage of Tryptophanyl Peptide Bonds by o-iodosobenzoic Acid//Methods in Enzymology. N. Y, 1983. Vol. 91. P. 311.

VI. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГРУПП В БЕЛКАХ И ПЕПТИДАХ

1. СВОБОДНЫЕ NHa-ГРУППЫ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ

Исследование концевых аминокислот в белках и пептидах играет важную роль в изучении как химической структуры, так и специфических биологических свойств этих соединений. Для определения N-KOH-цевых аминокислот широко используются динитрофторбензольный метод Сэнгера, фенилизотиоцианатный (метилизотиоцианатный) метод Эдмана и дансильный метод Грэя и Хартли.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ N-КОНЦЕВЫХ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ДИНИТРОФЕНИЛИРОВАНИЯ

В основе метода динитрофенилирования лежит реакция свободных NH2-rpynn белка или пептида с 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ) в щелочной среде, при которой образуются соответствующие динитрофенильные производные (ДНФ-производные). В реакцию с ДНФБ, кроме свободных a-NH2-rpynn, вступают также е-Г\ГН2-группа лизина, SH-группа цистеина, ОН-группы оксиаминокислот и имида-зольный гетероцикл гистидина. ДНФ-производное белка или пептида подвергают полному кислотному гидролизу. N-концевые ДНФ-амино-кислоты экстрагируют из гидролизатов эфиром, отделяя их от свободных аминокислот и ДНФ-производных по другим функциональным группам аминокислот, которые растворимы в воде. Идентификацию

^-производных аминокислот проводят с помощью электрофореза или хроматографии на бумаге или в тонком слое. Так как ДНФ-ами-нокислоты окрашены в желтый цвет, они не требуют дополнительного проявления на хроматограммах.

Реакцию белков и пептидов с ДНФБ и все последующие манипуляции следует проводить в темноте, так как ДНФ-производные на свету разлагаются. Необходимо также учитывать, что ДНФ-аминокисло-ты разрушаются и при кислотном гидролизе (особенно сильно разрушаются ДНФ-производные глицина, пролина, оксипролина, цистеина, триптофана, что требует дифференциальных условий гидролиза).

Определение N-концевой аминокислоты глютатиона

Реактивы:

1. 2,4-Динитрофторбензол — 2%-ный раствор в этиловом спирте.

2. NaHC03 —1-й 10%-ный растворы.

3. Смесь этилового спирта и эфира (1:1).

4. HCI перегнанная (с. 124) — 5,7 н. раствор.

5. Эфир, освобожденный от перекисей (добавляется закисное сернокислое железо, хранить на холоде).

6. Аммиак, уд. в. 0,8.

7. 2,4-Динитрофенол.

8. «-Бутиловый спирт, насыщенный 0,1%-ным раствором аммиака.

9. Спирт этиловый.

10. Пластинки «Силуфол».

11. ДНФ — аминокислоты-«свидетели».

Получение ДНФ-производного и его гидролиз. В центрифужную пробирку помещают 5—10 мг восстановленного глютатиона, добавляют 1 мл 10%-ного раствора NaHC03 и 0,5 мл 2%-ного раствора ДНФБ. Смесь перемешивают и инкубируют при 37 °С в течение 4 ч, периодически встряхивая.

ДНФ-производное глютатиона отделяют от избытка ДНФБ и соды добавлением 2—3 объемов этилового спирта и центрифугированием в течение 5 мин при 300 об/мин. Осадок промывают подкисленным этиловым спиртом (рН 3—4), затем дважды смесью спирта с эфиром и дважды эфиром. Осадок высушивают на воздухе под тягой, а затем в вакуум-эксикаторе над NaOH.

Осадок ДНФ-производного пептида переносят в ампулу, добавляют 1 мл 5,7 н. НС1 (перегнанной), отсасывают воздух и запаивают (с. 124). Препарат гидролизуют в течение 8 ч при 105°С. Гидролизат переносят в пробирку с притертой пробкой, разбавляют 1—2 объемами воды и экстрагируют ДНФ-производные аминокислот эфиром, свободным от перекисей. Экстракцию проводят 2—3 мл эфира несколько раз. Эфирный слой осторожно отсасывают капилляром в маленький стаканчик. После испарения эфира осадок растворяют в небольшом количестве ацетона и исследуют методом хроматографии. Оставшийся после экстракции эфиром водный раствор может быть использован для хроматографического определения водорастворимых ДНФ-произ-водных аминокислот.

Хроматография и количественное определение. При хроматографии на бумаге разделение проводят восходящим способом, используя в качестве растворителя бутанол, насыщенный 0,1%-ным раствором аммиака. Пропускание растворителя продолжают 15—20 ч. Для иденющие «свидетели». После идентификации пятна ДНФ-аминокислот вырезают, экстрагируют 4 мл 1%-ного раствора NaHC03 и измеряют оптическую плотность при 360 нм (380 нм для пролина).

Предварительно определяют величину коэффициента молярной экстинкции раствора ДНФ, приготовленного на 1%-ном растворе соды. По его величине и найденной оптической плотности для ДНФ-амино-кислоты рассчитывают содержание концевых аминокислот.

При использовании метода тонкослойной хроматографии разделение проводят на пластинках, покрытых силикагелем. Их можно приготовить в лаборатории (на поверхность стекла тонким слоем наносят суспензию силикагеля в воде) (с. 72). Разделение ДНФ-производных аминокислот можно проводить также на готовых стандартных пластинках, например «Силуфол». Размеры камеры определяются размером пластинки.

В качестве растворителя используют w-бутанол, насыщенный 0,1%-ным рас

страница 74
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
места на хранение вещей на время ремонта
Супермаркет техники KNSneva.ru предлагает LG 32MP58HQ-P - более 10 лет на рынке, Санкт-Петербург, Пушкинская, ул. Рузовская, д.11.
Viessmann Vitogas 100-F Block 132
наклейки на автономера против камер

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)