химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

с

о

ч

О"

Полнота расщепления полипептидной цепи зависит от окружения модифицированных остатков цистеина. Если с остатками цистеина соседствуют остатки валина, пролина, лейцина, тирозина, лизина, аланина и аспарагиновой кислоты, то расщепление идет на 90—95%.

Реактивы:

1. Буферный раствор — 40 мМ трис-HCl (рН 8,0), 6 М мочевина, 2 мМ ЭДТА.

2. Дитиотреитол.

3. ДТНБ.

4. Цианистый калий.

Внимание! Цианистый калий является сильно действующим ядом. Все работы с этим реактивом проводить только под тягой в присутствии преподавателя.

Белок растворяют в таком объеме 40 мМ раствора № 1, чтобы конечная концентрация остатков цистеина составляла 1 ? Ю-4—4-10~4 М. К раствору белка добавляют дитиотреитол до конечной концентрации ЫО"4—4-Ю-4 М и инкубируют 30 мин при 37°С. Далее к раствору белка добавляют раствор ДТНБ, приготовленный на том же буфере, до конечной концентрации, в 10 раз превышающей концентрацию SH-групп белка, и инкубируют 30 мин при 37 °С. Модифицированный белок подвергают цианолизу, добавляя к инкубационной среде водный раствор цианистого калия до конечной концентрации, в 20 раз превышающей концентрацию ДТНБ в инкубационной среде. Полученную смесь инкубируют при 37 °С в течение ночи. При необходимости по окончании инкубации образец можно обессолить на маленькой колонке с сефадексом G-50, уравновешенной 50—100 мМ бикарбонатом аммония. Полноту расщепления можно проверить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Не рекомендуется проводить расщепление полипептидной цепи при рН>9, так как в этих условиях ускоряется р-элиминирование тио-цианата. В том случае, если исследуемый белок содержит остатки ци-стина, для восстановления дисульфидных мостиков добавляют дитиотреитол до конечной концентрации 10 мМ и инкубируют 2 ч при 37 °С, после чего проводят гель-фильтрацию или диализ, чтобыt понизить концентрацию тиолов до 5-Ю-4— 1 • 10~~3 М. Все последующие операции проводят, как это описано выше.

ЛИТЕРАТУРА

1. ТорчинскийЮ. М. Сера в белках. М, 1977. С. 64, 77.

2. Degani У., Patchornik A. Cyanylation of sulfhydryl groups by 2—nitro thio-cyanobenzoic acid. High yield modification and cleavage of peptides at cysteine residue//Biochemistry. 1974. Vol. 13. P. 1.

3. Jacobson G. R., S с h a f f n e r M. H., Stark G. R. et al. Specific chemical cleavage in high yield at the amino peptide bonds of cysteine and cystine residues// //J. Biol. Chem, 1973. Vol. 248. P. 6583.

РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ОСТАТКАМ ТРИПТОФАНА

Известно несколько соединений, используемых для расщепления белка по остаткам триптофана: N-бромсукцинимид, BNPS-скатол (2-(2-нитрофенилсульфонил)-3-метил-3-броминдоленин), диметилсульф-оксид в соляной кислоте и о-йодозобензойная кислота22. Эти соединения действуют, как мягкие окислители триптофана. Однако механизмы реакций пока до конца не известны.

Наибольшей селективностью и эффективностью в отношении гидролиза пептидных связей, в образовании которых участвует триптофан, характеризуется о-йодозобензойная кислота:

/-\-cooh

[

ч/\

J0

22 Большинство перечисленных реагентов обладает недостатками в отношении разрыва белковой молекулы по остаткам триптофана. Эффективность гидролиза при использовании BNPS-скатола, например, составляет всего 60%; увеличение его кон центрации приводит к дополнительному разрыву триптофановых связей, однако при этом начинают гидролизоваться пептидные связи, образованные гистидином и тирозином.

Выход продуктов гидролиза колеблется от 70 (связи триптофана с ва-лином и изолейцином) до 100% (связи со всеми остальными аминокислотами). При блокировании SH-групп в белках окислению при ее использовании подвергаются только остатки метионина. Селективность гидролиза зависит от качества используемого препарата: примеси в виде о-йодоксибензойной кислоты приводят к разрыву связей по остаткам тирозина. Для разрущения о-йодоксибензойной кислоты применяют п-крезол.

Реактивы:

1. о-йодозобензойная кислота.

2. Гуанидинхлорид — 4 М раствор в 80%-ной уксусной кислоте.

3. я-крезол.

4. fJ-меркаптоэтанол.

5. СНзСООН - 20%-ный раствор.

Сухой образец белка растворяют в минимальном объеме 4 М раствора гуанидинхлорида в 80%-ной уксусной кислоте (концентрация белка 1—10 мг/мл). К раствору белка добавляют о-йодозобензойную кислоту, предварительно растворенную в минимальном объеме того же раствора. Содержимое пробы преинкубируют с /г-крезолом в течение 2—3 ч. Используют 0,2 моль /г-крезола на 1 моль о-йодозобензойной кислоты. Белок и о-йодозобензойную кислоту берут в соотношении 1 :2 (по весу). Гидролиз ведут в темноте при комнатной температуре в течение 24 ч. Реакцию останавливают добавлением |3-меркаптоэтанола. Реакционную смесь обессоливают на колонке (1,5X45 см) с сефадек-сом G-50 (fine), уравновешенной 20%-ным раствором уксусной кислоты. Гидролизат подвергают лиофилизации. Анализ полученного гид-ролизата проводят при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (с. 119).

ЛИТЕРАТУРА

страница 73
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
стул для посетителей изо хром
винтовой стул в москве

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(29.04.2017)