химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

Кроме того, гидролизу химотрипсином могут быть подвергнуты связи, образованные лейцином, валином, метионином и аспа-рагином.

21 Препараты трипсина не должны содержать примесей химотрипсина. С этой целью продажные препараты трипсина обрабатывают ингибиторами химотрипсина, в частности дифенилкарбамилхлоридом или Л^-тозил-^-фенилаланилхлорметилкетоном {TPCK).

Гидролиз химотрипсином проводят при 37° С в щелочной среде (рН 8,0—8,6). Отношение фермента к белку 1 : 100 (по весу). При длительном гидролизе фермент к субстрату добавляют двумя или тремя порциями. Природа буфера, используемого для гидролиза, зависит от характера последующей работы. При разделении пептидов гидроли-зата хроматографическими и электрофоретическими методами на бу

маге или в тонком слое удооно пользовании адс1римИ* uj^cpnmmn растворами, например 0,5%-ным раствором NH4HC03 (рН 8,2). При гидролизе химотрипсином получаются сравнительно мелкие пептиды.

Для изучения действия химотрипсина предлагается получить фрагменты миозина и провести их анализ (с. 396).

2. ХИМИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ

Полипептидные цепи при ферментативном гидролизе расщепляются на большое число сравнительно мелких пептидов, что затрудняет их разделение и идентификацию. Поэтому за последнее время все более широкое распространение приобретают методы химического расщепления пептидных связей, образованных аминокислотами, редко встречающимися в белках. Это позволяет получать ограниченное число крупных пептидов.

Среди методов расщепления полипептидных цепей химическим путем наибольшее распространение получили гидролиз белка по остаткам метионина (бромцианом), тирозина (N-бромсукцинимидом), триптофана (о-йодозобензойной кислотой и BNPS-скатолом) и по остаткам цистеина.

РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ОСТАТКАМ МЕТИОНИНА

Взаимодействие метионина с бромцианом и последующее расщепление полипептидной цепи протекает при сильно кислых значениях рН по схеме, представленной ниже:

сн3

I N=C S-CH3 N==c-S-CH3

1 U I

СН2 СН2 уО

—NH—С Н—СО—4 N Н—С Н —С-—VJH -NH-CH

СН2ОН /сн\

L _ сн2 о

\ 2 " I I л

—NH—СН—СООН NH СН С=0

гомосерин лактОН

Как видно из схемы, если расщепление происходит по одиночному остатку метионина внутри полипептидной цепи, то образуются 2 пептида, на С-конце одного из которых расположен остаток гомосе-рина. Если в полипептидной цепи есть 2 расположенных по соседству остатка метионина, то помимо двух пептидов образуется свободный гомосерин. Свободный гомосерин образуется и в том случае, если остаток метионина расположен на N-конце белка или пептида. Химическое расщепление полипептидной цепи бромцианом высокоспецифично и, как правило, протекает с высоким выходом.

Реактивы:

1. Муравьиная кислота или трифторуксусная кислота — 70%.

2. Сухой бромциан.

ш.

см. на с. 296.

Исследуемый белок растворяют в 70%-ном растворе муравьиной или трифторуксусной кислоты (концентрация белка 5—10 мг/мл) и добавляют сухой бромциан в 30—200-кратном молярном избытке по отношению к содержанию метионина. Реакцию проводят в пробирке или колбе со шлифом под тягой при 25°С в течение 12 ч (при использовании трифторуксусной кислоты) или 24 ч (при использовании муравьиной кислоты). После окончания инкубации реакционную смесь разводят в 10—15 раз водой. При этом негидролизованный белок может выпадать в осадок и удаляется центрифугированием. Смесь пептидов подвергают лиофилизации или упаривают на роторном испарителе. Как видно из схемы, в результате расщепления полипептидной цепи на С-конце образующихся пептидов находится либо остаток го-мосерина, либо гомосеринлактон. Для того чтобы перевести все С-кон-цевые аминокислоты образующихся пептидов в лактонную форму, смесь пептидов инкубируют 1 ч в трифторуксусной кислоте при 25 °С. Для перевода всех С-концевых аминокислот пептидов в форму гомо-серинлактона смесь пептидов инкубируют 15 мин в 0,1%-ном растворе NH4OH. Следует иметь в виду, что лактонная форма особенно удобна при определении первичной структуры белка на твердофазном сек-венаторе.

ЛИТЕРАТУРА

1. Д эвен и T, Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М., 1976. С. 170.

2. Croft L. R. Handbook of protein sequence analysis. Chichester, 1978. P. 19.

РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ОСТАТКАМ ЦИСТЕИНА

Метод расщепления состоит из следующих этапов: 1) остатки цистеина (или цистина) восстанавливают путем добавления избытка ди-тиотреитола; 2) сульфгидрильные группы модифицируют б^б'-дитио-бис- (2-нитробензойной кислотой) (ДТНБ); 3) модифицированный белок обрабатывают избытком цианистого калия, в результате чего SH-группы в структуре белка превращаются в SCN-группы; 4) при щелочных значениях рН (рН 8—9) в присутствии 6—8 М растворов мочевины или гуанидинхлорида происходит разрыв полипептидной цепи вблизи остатков (3-тиоцианоаланина (см. схему):

R?NO,

У

\

СООН

SH + O.N—^~ НООС

R-S\ \

СООН СООН

R

' V_ NO, + 2KCN -+.R —S—CN +

COOH

+ NC—SX-N02 \

COOH

о

Ф

H3N

C—NH—CHI

IJ I n

0] CH

I

N = C—S

O"

H3N

COOH +

HN S II/ 4

HN

CH2 О

II

СН—

страница 72
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
магнитная наклейка
курсы ландшафтного дизайна в москве для начинающих в свао
ремонт шлушителей
neo cosmo one-tone от neo vision gray серые

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(08.12.2016)