химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ку в 0,01 н. растворе НС117. Щелочной гидролизат и стандарт триптофана (при анализе триптофана в этом гидролизате) наносят на пластинку в растворе, состоящем из 2 н. NaOH, натрий-цитратного буфера, рН 3,3 (0,4 М по Na+) и 5,7 я. НС1, взятых в соотношении 2: 1,6: 1.

Сухой гидролизат (1—3 мг белка) !8 растворяют так, чтобы конечная концентрация каждой аминокислоты составляла около 5 мМ. Эту величину подсчитывают, исходя из количества белка (в мкмолях), взятого на гидролиз, и среднего содержания в белке каждой из 20 аминокислот (сумма аминокислот в белке, деленная на 20). Количество аминокислот в белке определяют либо из данных литературы, либо разделив молекулярную массу белка на 100 (средняя молекулярная масса аминокислоты).

16 При анализе смеси, состоящей из небольшого числа хорошо разделяемых аминокислот, пластинку можно не уравновешивать буфером.

17 Образцы можно растворять в смеси НСООН — СН3СООН — Н20 (7:5:13)

или в фосфатно цитратном буфере (0,7 мл 0,2 М раствора NasHPO*; 19,6 мл 0,1 М

раствора лимонной кислоты; вода — до 200 мл).

18 При анализе щелочного гидролизата (с. 125) количество белка, подвергаемое

гидролизу, выше и составляет около 10 мг.

Растворы наносят на пластинку микрошприцами, микропипетками или калиброванными капиллярами (следует избегать повреждения слоя смолы) на стартовую линию, расположенную в 2—3 см от нижнего края пластинки, в виде пятна (диаметр не более 3 мм) или полосы. На пластинку наряду с опытной пробой наносят стандартные растворы аминокислот в том же растворителе, что и гидролизат, в количестве 0,01—0,03 мкмоль каждой аминокислоты в пятне. Пластинку с нанесенным образцом помещают в хроматографическую камеру, на дно которой слоем 1 см наливают один из буферных растворов № 1-3.

Раствор № 1 Раствор № 2

Na-цитратный буфер (0,4 М Na-цитратный буфер

по Na+), рН 3,3; (0,2 М по Na+), рН 3,28;

лимонная кислота — 84 г; лимонная кислота — 14,1 г;

NaOH - 16 г; NaOH - 8,0 г;

НС1 концентриро- НС1 концентрированная — 5,9 мл; ванная — 12,3 мл;

Н20 — до 1 л. глицерин — 100,0 мл;

Н20 — до 1 л.

В растворах № 1 или № 2 хорошо разделяются следующие смеси аминокислот:

смесь А — аргинин, гистидин, тирозин, изолейцин, валин, аланин,

глутаминовая кислота; смесь Б — лизин, фенилаланин, лейцин, метионин, глицин, треонин, аспарагиновая кислота. Их готовят смешиванием в равных объемах растворов аминокислот-свидетелей» с концентрацией 50 мМ.

Для определения триптофана в щелочном гидролизате белка используют раствор № 3:

Na-цитратный буфер (1,5 М по Na+) рН, 6,0:

лимонная кислота — 7 г;

NaOH - 4 г;

NaCl - 81,9 г;

Н20 — до 1 л.

Разделение аминокислот проводят в закрытой камере, насыщенной парами растворителя, восходящим способом при 50° С. После окончания хроматографии (60—90 мин, растворитель должен подняться по пластинке на расстояние примерно 18 см) вынутую из камеры пластинку высушивают на воздухе и проявляют раствором нингидрина. Для этого пластинку осторожно опрыскивают из пульверизатора19 0,1%-ным раствором нингидрина в ацетоне. Для получения стойкой окраски хроматограмму можно проявлять нингидриновым реактивом, содержащим кадмий. Его готовят смешиванием в отношении 5:1 (по объему) двух растворов:

1) 1%-ного раствора нингидрина в ацетоне;

2) 1 г уксуснокислого кадмия в смеси, содержащей 50 мл ледяной

уксусной кислоты и 100 мл воды.

Пластинки проявляют в темноте при комнатной температуре или в термостате при 105°С (около 10 мин).

19 Пульверизатор должен обеспечивать мелкое распыление жидкости.

На пластинках «Фиксион 50x8» при однократном пропускании растворителя могут быть разделены 14—16 аминокислот, входящих в состав белка (рис. 19,А). В случае недостаточно хорошего разделения смеси аминокислот одномерным способом прибегают к двумерной хроматографии, пропуская тот же или другой растворитель в направлении, перпендикулярном предыдущему. На практике поступают следующим образом. В две точки стартовой линии хроматограммы на расзимний z,o см друг от друга и I см от края хроматограммы помещают исследуемый раствор. После однократного пропускания раствориасп

mpe+ct i глу

цис гла ала

I

Й S~ ^ <; о<з S 5 1ъ s ^ а а (з 5 S м м а ^-<ё * =з ^ S S- ч ^

Рис. 19. Разделение стандартной смеси аминокислот на пластинках «Фиксион 50х8з

(Л — одномерное, Б — димерное)

теля пластинку высушивают, отрезают от нее часть, соответствующую

крайней стартовой точке хроматограммы, и проявляют нингидрином.

В случае плохого разделения оставшуюся большую часть пластинки

поворачивают на 90° и снова помещают в тот же самый или другой

растворитель. Проводят повторное хроматографирование во втором

направлении. После высушивания пластинку проявляют нингидрином

(рис. 19,5). 1

Количественное определение аминокислот. Для оценки количественного содержания аминокислот в исследуемом образце белка наряду с гидролизатом в отдельные точки хроматограммы наносят растворы аминокислот-«свидетелей». Стандартные растворы ам

страница 69
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
хороший учебный центр по веб разработке
мед центр в москве
сколько стоит исправить небольшую вмятину
зарядка для гироскутера тц экстрим

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)