химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ом ацетоне. Основной раствор флуорескамина (2 мг/мл безводного ацетона) может храниться при 4°С в течение нескольких месяцев. Рабочий раствор флуорескамина готовят из основного раствора: к 80 мл сухого ацетона добавляют 0,4 мл основного раствора. Продукт реакции имеет 2 максимума поглощения при 300 и 390 нм, максимум флуоресценцией при 480 нм.

Флуорескамин и о-фталевый альдегид могут быть использованы для количественного определения белков и пептидов. При работе с флуорескамином белки открываются в количестве 0,05—0,5 мкг.

13 Пиридин кипятят и перегоняют над КОН, затем кипятят и перегоняют над

нингидрином (2 г на 2 л). Температура кипения 159°С

14 Ацетон кипятят с КМп04 (5 г/л ацетона) 3—4 ч Охлаждают, добавляют новую порцию КМпО< (2 г/л) и кипятят еще 1—2 ч Ацетон выдерживают в течение

ночи над свежевысушенным СаС12 (2 г/л). Перегоняют над СаСЬ

Для определения белков с помощью флуорескамина к анализируемому препарату, растворенному в 2 мл 0,05 М калий-фосфатного буфера (рН 7), добавляют 10 мкл ацетонового раствора флуорескамина*

(2 мг/мл), пробы перемешивают в течение 30 с и измеряют флуоресценцию при 475 нм на флуориметре. Длина волны возбуждения света 385 нм.

Специфические реакции на отдельные аминокислоты. Наряду с нингидриновым реактивом существуют и другие реагенты, дающие цветные продукты с некоторыми аминокислотами. Это свойство избирательного окрашивания часто используют в хроматографии для идентификации отдельных аминокислот. Так, для определения соединений с гуанидиновой группой (аргинин) используют реакцию Сакагуши. Хроматограмму смачивают 0,1%-ным раствором 8-оксихинолина в ацетоне и после ее подсушивания на воздухе слегка опрыскивают из пульверизатора раствором гипобромита (1 мл брома в 500 мл 0,5 н. NaOH). Наблюдается оранжевое окрашивание.

Реакция Эрлиха. Производные индола и оксииндола (триптофан, 5-окситриптофан, 5-окситриптамин, 5-оксииндолуксусная кислота) с реактивом Эрлиха дают лиловую окраску. Хроматограмму погружают в раствор, состоящий из смеси 1 объема 10%-ного раствора диме-тиламинобензальдегида в концентрированной НС1 с четырьмя объемами ацетона. Окраска развивается через 20 мин при комнатной температуре.

Реакция Паули. Соединения, содержащие имидазольное кольцо (гистидин, метилгистидин, гистамин, карнозин), а также тирозин, дают красно-оранжевое окрашивание после обработки диазореактивом ('с. 192). Хроматограмму из пульверизатора слегка опрыскивают сначала диазореактивом, а затем 10%-ным раствором Na2C03. Окраска устойчива. Перечисленные реакции можно применять после проявления хроматограммы нингидрином.

Для обнаружения материала, имеющего пептидные связи, но не дающего нингидриновую реакцию (например, циклических пептидов), применяют реакцию Райдона и Смита. С этой целью хорошо высушенную хроматограмму смачивают в смеси спирта и эфира (1:1). Избыток растворителя удаляют фильтровальной бумагой. Влажную хроматограмму помещают в замкнутое пространство над свежеприготовленной смесью 10%-ной соляной кислоты и 1%-ным раствором КМп04 (1:1) на 5—15 мин. Погружают хроматограмму в смесь 0,05 н. раствора KI и насыщенного раствора о-толидина (или бензидина) в 2%-ной уксусной кислоте (1:1)

о-Толидин и бензидин токсичны, их набирают только пипеткой с грушей или автоматической пипеткой!

На месте пептидов и белков появляются синие пятна. Через 1 — 3 мин хроматограмму промывают 2%-ным раствором СНзСООН и высушивают на воздухе Окраска устойчива. Для пептидов эта реакция более чувствительна, чем нингидриновая. Реакцию дают также пури-яовые и пиримидиновые основания, нуклеозиды, нуклеотиды и др.

Количественное определение аминокислот

Количественное содержание аминокислот рассчитывают по калибровочным графикам, построенным после хроматографирования стандартных растворов аминокислот, взятых в различных количествах. Для каждой аминокислоты строят свой калибровочный график. В ряд точек хроматограммы наносят стандартные растворы аминокислот в количестве 0,05—0,20 мкмоль каждой. В качестве стандартных растворов удобно пользоваться смесями аминокислот известного состава, хорошо разделяющимися в данных условиях и содержащими определен5*

131

ные количества аминокислот. Этим требованиям удовлетворяют смеси а и б аминокислот-«свидетелей», используемые в качественной хроматографии (с. 128). Стандартные смеси готовят из 50 мМ стандартных растворов отдельных аминокислот, приготовленных на смеси муравьиная кислота — уксусная кислота — вода смешиванием по 1 мл (0,5 мл) раствора каждой аминокислоты. Стандартные растворы аминокислот наносят на ту же хроматограмму, что и опытные пробы. После проявления хроматограммы окрашенные участки обводят простым карандашом, вырезают, измельчают ножницами, помещают в пробирки и приливают 3—5 мл раствора для элюции. Пробы до колориметрирования необходимо периодически встряхивать и держать в темноте. Элюаты начинают колориметрировать, когда в раствор полностью переходит краска из наиболее интенсивно окрашенных пятен (обычно через 30—60 мин). Опр

страница 67
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
fastwheel f0
Отрывной календарь на 2014 год Carpe diem
железные прутики купить
виртуальная кабина самолета аттракцион

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.06.2017)