химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

при данных условиях хроматографирования. Этим требованиям удовлетворяют смеси аминокислот следующего состава:

а) цистеиновая кислота, гистидин, аспарагиновая кислота, глицин,

глутаминовая кислота, аланин, триптофан, метионин, фенилаланин,

лейцин;

б) цистеиновая кислота, лизин, аргинин, серии, треонин, аланин,

пролин, тирозин, валин, изолейцин.

Смеси «свидетелей» помещают в крайние точки стартовой линии хроматограмм по 0,05—0,1 мкмоль каждой аминокислоты в пятно.

Для лучшего насыщения камеры ее стенки оклеивают листами фильтровальной бумаги, смоченной водой (иногда и органическим раство1 ое

Хроматограмму укрепляют в лодочке для нисходящей хроматографии и помещают в хроматографическую камеру (рис. 17), предварительно насыщенную парами воды и органического растворителя.

рителем). 1акое насыщение предотвращав испарение ^юиршелл при движении его по бумаге.

В качестве растворителей для хроматографии аминокислот обычно используют последовательно 2 системы:

1) «-бутиловый спирт — уксусная кислота — вода (4:1:5); компоненты смеси тщательно встряхивают 5—10 мин в делительной воронке и после расслаивания используют верхний слой;

2) «-бутиловый спирт — уксусная кислота — вода (8:3:1).

Для лучшего разделения сложной смеси аминокислот, имеющих -близкие величины Rf, пропускание каждого растворителя по хромато-грамме повторяют несколько раз (обычно дважды). В этом случае фронт каждого последующего растворителя должен продвигаться по бумаге несколько дальше предыдущего. Перед использованием каждого следующего растворителя хроматограммы вынимают из камеры и высушивают на воздухе.

Для оптимального разделения некоторых аминокислот, плохо отделяющихся друг от друга в перечисленных системах, используют и другие растворители, которые приведены в соответствующих руководствах (см., например: Хроматография на бумаге//Под ред. И. Хайса и К. Мацека. М., 1962). Так, для отделения валина от фенилаланина (проблема, возникающая при анализе антибиотика грамицидина С, состоящего всего из пяти разных аминокислот) можно рекомендовать последовательное пропускание двух растворителей: систему 2-бута-нол — 3%-ный аммиак (3:1), а затем систему н-бутанол — уксусная кислота — вода (8:3:1).

Идентификация аминокислот

Аминокислоты открывают с помощью соединений, образующих с ними окрашенные или флуоресцирующие продукты. Наиболее широкое распространение для идентификации аминокислот получил нингидрин. Продукт реакции с нингидрином имеет сине-фиолетовую окраску с максимумом поглощения при 570 нм (для пролина 440 нм).

Проявление нингидрином. Раствор нингидрина наливают в ванночку и равномерно пропитывают им хроматограмму. Хроматограмму высушивают под тягой и выдерживают в темноте при комнатной температуре около 12 ч. В этих условиях с нингидрином реагируют все а-аминокислоты (другие аминокислоты дают реакцию при более высокой температуре — около 100°С). Проявление хрома-тограмм при качественной хроматографии можно ускорить, помещая последние на 5—10 мин в термостат при 60° С. Окраска, получаемая при проявлении аминокислот нингидрином, неустойчива. Ее можно закрепить, опрыскивая проявленную хроматограмму из пульверизатора раствором ацетона, содержащим азотнокислую медь. Стойкую окраску можно получить при внесении в нингидриновый реактив кадмия (с. 135) или стронция. Окраска сохраняется в течение нескольких недель при проявлении аминокислот смесью 1%-ного раствора нингидрина в ацетоне и 1%-ного раствора хлористого стронция в 20%-ном растворе СН3СООН (1:6).

Сопоставляя положение аминокислот гидролизата с положением аминокислот-«свидетелей», определяют аминокислотный состав гидролизата.

Проявление флуорескамином. Помимо нингидрина для проявления аминокислот в настоящее время используют реагенты, дающие с аминокислотами^ пептидами и белками флуоресцирующие

5 Зак 416

129

ж . u.^wi.v./: ^^jvjjjc^tvdMHH ^пшаш; и о-фталевыи диальдегид. Последний реагирует с первичными аминами в присутствии восстановителей (6-меркаптоэтанола).

;N—R

н

SCH2CH2OH

»о-фталевый диальдегид

Образование продуктов, обладающих флуоресценцией (сами реагенты не флуоресцируют), позволило значительно увеличить чувствительность метода. С флуорескамином открывается Ю-9—Ю-11 молей аминокислот. В отличие от нингидрина реакции не мешает присутствие аммиака. Реакция протекает при комнатной температуре при рН 7,0— 9,0. Поскольку флуорескамин в водной среде разрушается (в течение нескольких секунд), для приготовления раствора используют безводные жидкости (ацетон, ацетонитрил, диметилсульфоксид и др.). Продукт реакции стабилен в течение нескольких часов. Пептиды и белки, проявленные флуорескамином, могут использоваться для определения аминокислотного состава и аминокислотной последовательности.

При проявлении флуорескамином высушенную хроматограмму погружают в 3—5%-ный раствор пиридина13 в безводном ацетоне1-4. Высушивают 5 мин на воздухе. Затем ее опрыскивают из пульверизатора 0,001—0,005%-ным раствором флуорескамина в безводн

страница 66
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
облицовочный кирпич для цоколя
шкафы управления для электрокалориферов сфо
бутсы по оптовым ценам
metalldizain-md-412-slim

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.05.2017)