химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ется на стартовой линии, следует увеличить гидрофильность системы, например, добавлением муравьиной кислоты, метанола или формамида. Если же вещество хорошо растворимо в подвижной фазе и движется вместе с фронтом растворителя, следует использовать органический растворитель с более выраженными гидрофобными свойствами, например изо-амиловый, бензиловый спирты и др.

Для лучшего разделения соединений с близкими значениями Ri, а также для увеличения Rf часто проводят хроматографирование в нескольких (обычно двух) системах растворителей, пропуская второй растворитель в том же направлении, что и первый. Это приводит к уплощению пятен разделяемых соединений в направлении, перпендикулярном пропускаемому растворителю, и способствует их лучшему разделению. Более полное разделение аминокислот и пептидов достигается при двухмерной хроматографии (второй растворитель пропускают в направлении, перпендикулярном первому) или при сочетании хроматографии (одно направление) и электрофореза (второе взаимно перпендикулярное направление). Последний метод носит название метода «пептидных карт» или «отпечатка пальцев».

При повторном разделении в системах растворителей положение пятна на хроматограмме устанавливают путем определения значений коэффициента относительной скорости движения Rst, где

D расстояние анализируемого соединения от старта

*расстояние стандарта от старта

В качестве стандарта можно использовать одно из веществ разделяемой смеси. Получаемые значения Rst являются более воспроизводимыми, чем величина Rf.

Реактивы:

1. Хроматографическая бумага: ватман 1—4, FN 2—5 или ленинградская,

2. «-Бутиловый спирт.

3. СзНСООН — концентрированная.

4. Изопропнловый спирт.

5. Растворы аминокислот-«свидетелей». 50 мМ растворы отдель1 ных аминокислот в смеси муравьиная кислота — уксусная кислота — вода в объемных отношениях 7:5:13.

6. Раствор для окрашивания. 0,2%-ный раствор нингидрина на смеси: 95 мл ацетона, 4 мл воды, 1 мл ледяной уксусной кислоты; готовят непосредственно перед употреблением.

7. Раствор для закрепления окраски. 10 мл водного насыщенного раствора CuN03 смешивают с 0,2 мл азотной кислоты и 100 мл ацетона. Полученную смесь фильтруют.

8. Раствор для элюции аминокислот из бумаги. 500 мл этанола смешивают с 0,2 мл насыщенного водного раствора CUSO4.

Подготовка бумаги 12. Вырезают полосу бумаги, размеры которой определяются количеством исследуемых проб и величиной хромато-графической камеры. В 5—10 см от конца полосы (зависит от высоты лодочки) проводят простым карандашом стартовую линию и отмечают точки нанесения раствора в 3 см от краев хроматограммы и в 2,5 см одна от другой. Для лучшего разделения образцов с большим набором аминокислот край бумаги, на который наносят гидролизат, вырезают, как это показано на рис. 16.

Получение хроматограммы. Гидролизат после упаривания на роторном испарителе растворяют в 0,5 мл смеси муравьиная кислота — уксусная кислота — вода. Гидролизат можно растворять также в смеси изопропанол — вода (1:9). В этом случае, если необходимо для лучшего растворения, добавляют каплю концентрированной уксусной кислоты или концентрированного аммиака, что определяется экспериментальным путем в отдельной пробе.

Простым карандашом делают надписи на хроматограмме. В центральные точки

Рис. 16. Форма бумажной полосы, обеспечивающая лучшее разделение аминокислот (размеры даны в миллиметрах-, а — точки нанесения образца)

12 Все операции при работе с бумажными хроматограммами и электрофореграм-мами, включая подготовку бумаги, следует проводить в чистых резиновых перчатках, чтобы избежать попадания аминокислот с кожи пальцев на бумагу.

1 от

стартовой линии хроматограммы наносят различные количества анализируемого гидролизата. Вносят в одну точку такое количество гидролизата, в котором содержание каждой из аминокислот составляет в среднем 0,1—0,2 мкмоль. Для подсчета этой величи

ны рекомендуется исходить из микромолярной концентрации белка (пептида), взятого для гидролиза, и суммарного содержания аминокислотных остатков в полипептидной цепи (с. 134). Для нанесения гидролизата на бумагу можно пользоваться микрошприцем, полуавтоматической пипеткой, микропипеткой на 0,1 мл с оттянутым в капилляр и изогнутым концом или калиброванным капилляром. Диаметр наносимых пятен не должен превышать 0,3—0,5 см (объем каждой капли около 0,003—0,005 мл). При нанесении раствора в одну и ту же точку бумаги соответствующее место каждый раз подсушивают током теплого воздуха. Если расстояние между точками нанесения превышает 2,5 см, раствор можно наносить в виде полосы.

Для идентификации аминокислот в исследуемом гидролизате наряду с опытными пробами (или предварительно, до анализа опытных проб) на хроматограмму наносят растворы аминокислот-«свидетелей». После установления местоположения пятен отдельных аминокислот-свидетелей» последние в дальнейшем на хроматограмму можно наносить в составе смесей. Смеси должны иметь известный состав и хорошо разделяться

страница 65
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
descente в ульяновске
Интернет-магазин КНС Нева предлагает купить сенсорный моноблок - онлайн кредит во всех городах России.
переходник для установки ксенона на форд фокус 2 рестайлинг
песочница для детской площадки купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)