химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

,5—1 ч. Затем гели прокрашивают раствором кумасси #-250 в течение 2—3 ч. Избыток краски удаляют промыванием 10%-ным раствором СН3СООН.

Обработка электрофореграмм. Определяют расстояние, пройденное каждым белком от стартовой линии. Определение можно проводить визуально или с помощью денситометра при 550—600 нм. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс длину пути 1а, пройденного данным белком, а по оси ординат — логарифм его молекулярной массы. Определив длину пути, пройденного белком с неизвестной молекулярной массой 1Х, пользуясь калибровочным графиком, определяют молекулярную массу исследуемого белка. При проведении электрофореза в трубочках часто трудно получить хорошо воспроизводимые результаты на разных трубках. В этом случае определяют не абсолютную, а относительную подвижность белков. Для этого определяют отношение длины пробега белковой зоны либо к общей длине геля, либо к длине пробега лидирующего красителя. После этого строят зависимость относительной подвижности белков от логарифма их молекулярной массы.

МЕТОД ЛЭММЛИ

Реактивы:

1. Акрил амид — 30%-ный раствор, приготовленный на 0,4%-ном

растворе метиленбисакриламида. 29,6 г акриламида и 0,4 г метиленбисакриламида растворяют в воде и объем раствора доводят до 100 мл. Раствор хранят в темной склянке в холодильнике.

Внимание! Работу с акриламидом проводят под тягой, в перчатках!

2. Буфер для приготовления разделяющего геля — 1,5 М трис-НС1 буфер, содержащий 0,4%-ный ДСН, рН 8,8.

3. Буфер для приготовления концентрирующего геля — 0,5 М трис-HCl буфер, содержащий 0,4%-ный ДСН, рН 6,8.

4. Электродный буфер: 0,025 трис-0,192 М глицин, рН 8,6. Необходимую навеску глицина растворяют в воде и добавляют сухой трис до рН 8,6, после чего объем раствора доводят водой до нужной величины. Электродный буфер катодного отделения камеры содержит помимо указанных компонентов ДСН в концентрации 0,1 %.

5. Буфер для приготовления образцов: 0,0625 М трис-HCl буфер, рН 6,8, 2%-ный ДСН, 10%-ный раствор сахарозы (или глицерин), 0,001%-ный бромфеноловый синий. Перед употреблением в указанный раствор добавляют |3-меркаптоэтанол до конечной концентрации 5%.

6. Персульфат аммония.

7. ТЕМЕД.

8. Изопропиловый спирт — 70%-ный раствор.

9. Уксусная кислота — 10%-ный раствор.

10. Кумасси #-250 — 0,04% -ный раствор, приготовленный на смеси: изопропанол—этанол—уксусная кислота—вода в соотношении 2:1:1:6.

11. Набор белков-маркеров с известной молекулярной массой (с. 120).

Приготовление геля. Для полимеризации 30 мл разделяющего геля (12,5%) смешивают 12,5 мл раствора акриламида, 7,5 мл буфера разделяющего геля и 10 мл воды. После деаэрирования (5—10 мин на водоструйном насосе) к смеси добавляют 16 мг персульфата аммония и 18 мкл ТЕМЕД. Полученный раствор заливают либо в гелевую ячейку для вертикального электрофореза в пластине (с. 97), либо в трубки (с. 95). На поверхность раствора наслаивают воду. После полимеризации удаляют воду шприцом или фитилем из фильтровальной бумаги. Готовят смесь для концентрирующего геля. Смешивают 4 мл раствора № 1 с 5 мл буфера концентрирующего геля и добавляют 11 мл воды (суммарный объем 20 мл). Полученную смесь деаэрируют, добавляют 15 мг персульфата аммония и 16 мкл ТЕМЕД и наносят на вершину уже заполимеризовавшегося разделяющего геля. Обычно длина концентрирующего геля в 5—6 раз меньше длины разделяющего геля. На поверхность полимеризуемых гелей наслаивают воду.

Подготовка образцов. Исследуемые и стандартные белки-маркерьг растворяют в буферном растворе для приготовления образцов в концентрации 1—2 мг/мл и нагревают 5—10 мин на кипящей водяной бане. Исследуемые образцы белков не должны содержать ионов К+ и NH+4 (с 120).

Электрофорез и обработку электрофореграмм проводят, как описано на с. 120.

ЛИТЕРАТУРА

1. Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М., 1985.

2. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам/Под ред* О. Микеша. М., 1982. Т. 1.

3. Я кубке Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки. М., 1985.

4. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М„ 1981.

5. Маурер Г. Диск-злектрофорез. М., 1971.

6. Д о и с Э. Количественные проблемы биохимии. М., 1983.

7. Шелудько Н. С. Белковый состав миофибрилл кролика, определенный методом диск-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия/ЛДитологня, 1974. Т. 15. С. 597.

8. L а е m m 1 i U. К. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T—4//Nature. 1970. Vol. 227. P. 681.

IV. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ

Химические, физико-химические свойства белков и их структура определяются аминокислотным составом. Поэтому исследование аминокислотного состава является важным аналитическим методом характеристики этих соединений. Исследование аминокислотного состава белков и пептидов включает расщепление этих соединений до свободных аминокислот, разделение последних, их идентификацию и количественное определение. Из

страница 62
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
мастер холодильных установок обучение
исправление вмятин на капоте в новосибирске
компьютерный стол мебелайн «мебелайн – 39»
ремонт автомобильных холодильников.

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(07.12.2016)