химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ное стандартным белком, например цитохромом с или химо-трипсиногеном А), по оси ординат — логарифм молекулярной массы данного белка. Определив расстояние белковой зоны исследуемого ?белка от старта, по калибровочному графику находят его молекулярную массу.

3. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ В ПРИСУТСТВИИ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТА НАТРИЯ

Белки, обработанные концентрированным раствором додецилсуль-4>ата натрия в присутствии (З-меркаптоэтанола, распадаются на отдельные полипептидные цепи и приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий собственный заряд белковой молекулы. При последующем разделении с помощью диск-электрофореза в поли-акриламидном геле белковые зоны распределяются на электрофоре-граммах таким образом, что подвижность белковой зоны обратно пропорциональна логарифму молекулярной массы. Метод дает возможность определять молекулярные массы субъединиц олигомерных белков. Электрофоретическое разделение можно проводить различными методами. Ниже описаны два из них: метод Вебера и Осборн, а также метод, предложенный Лэммли.

В методе Вебера и Осборн буферные растворы для приготовления геля и электродный не отличаются между собой. Обычно используют 0,1 или 0,05 М натрий-фосфатный буфер. В методе Лэммли гелевый и электродный буферные растворы отличаются друг от друга по составу и величине рН. Кроме того, используют два типа гелей — концентрирующий и разделяющий. Эти модификации приводят к тому, что на границе между концентрирующим и разделяющим гелем весь белковый образец собирается в виде узкого диска. Это способствует более четкому разделению белков.

МЕТОД ВЕБЕРА И ОСБОРН Реактивы:

1. Акриламид — 30%-ный раствор, содержащий 0,6% метилен, бисакриламида.

ип.шаппь. raouiy v, ал уил амидом ПРОВОДЯТ ПОД ТЯГОЙ, В Перчатках!

2. Буфер для приготовления геля — 0,2 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,2.

3. Буфер для приготовления образцов — 0,02 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,2.

4. Электродный буфер — 0,05 М натрий-фосфатный буфер,. рН 7,2.

5. Персульфат аммония — 15 мг/мл (готовят непосредственно перед употреблением).

6. ТЕМЕД.

7. Сахароза — 40%-ный раствор.

8. Изопропиловый спирт — 70%-ный.

9. Краситель кумасси i^-250 — 0,04%-ный раствор, приготовленный на 20%-ном изопропаноле и 10%-ной СН3СООН.

10. Уксусная кислота — 10%-ный раствор.

11. Додецилсульфат натрия (ДСН) — 10%-ный раствор.

12. р-меркаптоэтанол.

13. Набор белков-маркеров с известной молекулярной массой

В качестве белков-маркеров можно использовать следующие белки: фосфорилаза (91 000 Да), бычий сывороточный альбумине (68 000 Да), яичный альбумин (42 000 Да), химотрипсиноген А (27 000 Да), ингибитор трипсина из сои (24 000 Да), РНК-аза (14 000 Да), цитохром с (12 000 Да) и др.

Подготовка образцов. В растворы опытных и стандартных белков, содержащие 2—5 мг/мл, добавляют 10%-ный ДСН до конечной концентрации 1% и (3-меркаптоэтанол (для предотвращения неспецифической агрегации полипептидных цепей) до конечной концентрации 1—5%. Образцы выдерживают 5 мин при температуре 90° С. Если опытные или стандартные образцы находятся в растворах, содержащих ионы К+ или NH4+, перед обработкой ДСН их нужно обессолить диализом или гель-хроматографией, так как додецилсульфат калия и аммония плохо растворимы в воде.

Приготовление геля. Сливают в эрленмейеровскую колбочку 10 мл раствора акриламида, 15 мл фосфатного буфера, содержащего 30 мг ДСН, 3,5 мл Н20, 1,5 мл персульфата аммония и 0,04 мл ТЕМЕД. Далее поступают, как указано на с. 95.

Проведение электрофореза. Разделение можно проводить как в трубочках (с. 95), так и на пластинах для вертикального электрофореза (с. 97). После обработки ДСН к образцам добавляют сахарозу (до концентрации 10%) и в качестве лидирующего красителя — бромфеноловый синий (до концентрации 0,001%). Образцы исследуемых белков и белков-маркеров наносят на поверхность геля в объеме от 20 до 100 мкл (каждого или смеси нескольких образцов) и осторожно наслаивают электродный буфер. Нагрузка на гель определяется методом окраски гелей, а также способностью того или иного белка связывать используемый краситель. Как правило, при электрофорезе в трубочках удается обнаружить от 20 до 100 мкг белка, при электрофорезе в пластинке — от 4 до 15 мкг. В электродный буфер катодного отделения добавляют ДСН до концентрации 0,1%. Электрофоре-тическое разделение проводят при комнатной температуре и силе тока 8 мА на трубочку. При этом сначала устанавливают силу тока -2 мА на трубочку (напряжение около 50 В), напряжение поднимают до 100—200чВ лишь после того, как образцы войдут в гель. При проведении электрофореза в пластине напряженность электрического поля сначала устанавливают равной 6—7 В/см, после проникновения образцов в разделяющий гель напряженность можно увеличивать до 15—20 В/см. Разделение проводят до тех пор, пока краситель не пройдет 4/5 всей длины геля. Обычно это занимает 4—6 ч. После этого электрофорез прекращают, вынимают гель и помещают его для фиксации в 70%-ный изопропанол на 0

страница 61
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить сковороду из нержавеющей стали в магазинах волгограда
шашки такси в нижнем новгороде
picnic 2016
официальный сайт стулья lm

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.05.2017)