химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

нки. Для колонки 1,5x50 см он равен 20 мл (объем собираемого элюата между нанесением отдельных образцов составляет 20 мл). Во время нанесения белков колонку перекрывают. Элюат, вытекающий из колонки со скоростью 15— 20 мл/ч, собирают небольшими порциями (1—3 мл). Строят профиль элюции отдельных белковых фракций (с. 108). Затем строят график зависимости отношения объема выхода белка к свободному объему колонки Ve/Vo или величины Kav от логарифма молекулярной массы белков.

После построения калибровочного графика на колонку наносят исследуемый белок и, определив объем элюции, находят по графику его молекулярную массу.

2. ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЯ В ТОНКОМ СЛОЕ СЕФАДЕКСА

По мере продвижения раствора по пластинке с нанесенным на нее тонким слоем геля сефадекса смесь белков распределяется в нем таким образом, что расстояние, пройденное каждым белком от линии старта, пропорционально логарифму его молекулярной массы. Построив калибровочный график зависимости расстояния, пройденного белками-маркерами, от логарифма их молекулярной массы и определив длину пути, пройденного исследуемым белком, можно определить его молекулярную массу.

Реактивы:

9 Цитохром с достаточно наносить в количестве 2 мг, гистон Я i — в количестве

5 мг.

1. Сефадекс G-200 или G-150 (superfine).

2. Фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 7,4.

3. Бромфеноловый синий — 0,1%-ный раствор, приготовленный на смеси этанол — концентрированная уксусная кислота (9:1).

4. иМз^иин — 5%-ный раствор.

5. CH3COONa — 2%-ный раствор на 10%-ном растворе СНзСООН.

6. Набор белков-маркеров с известной молекулярной массой. Кроме белков, указанных на с. 107, можно использовать химо-трипсиноген А (25 700 Да), креатинкиназу из мышц кролика (80000 Да), глицеральдегидфосфатдегидрогеназу (144 000 Да),, пируваткиназу (237 000 Да) и др.

7. Хроматографическая бумага — ватман 3 ММ.

4 г сухого сефадекса суспендируют в избытке фосфатного буфера и оставляют набухать в течение 3 сут при комнатной температуре или в течение нескольких часов при 60° С. Перед нанесением на стеклянную пластинку (20x40 см), которая должна быть вымыта с особой тщательностью, избыток буфера над гелем декантируют, а гель перемешивают и наносят фарфоровой ложкой на пластинку, расположенную на столике со строго горизонтальной поверхностью (горизонтальность проверяют с помощью уровня). Слой геля распределяют по пластинке стеклянной палочкой размером 1X22 см с надетой на концы резиновой трубкой, прокатывая палочку вдоль пластинки несколько раз для получения равномерного слоя геля толщиной 1 мм (без комочков и пузырьков воздуха). Пластинку подсушивают на воздухе в течение 15 мин, а затем помещают в средний отсек камеры (рис. 15). Крайние резервуары заливают 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,4), слой геля соединяют с буферным

Рис. 15. Оборудование для хроматогра-фического разделения белков в тонком"

слое сефадекса. 1 — столик с переменным углом наклона; 2 — хроматографическая камера {а,, в — отсеки, заполненные буферным раствором; б — отсек, в который помещают стеклянную пластинку), 3 —стеклянная пластинка, покрытая гелем сефадекса; 4 — соединительные мостики из фильтровальной бумаги; 5 — скользящая крышка; 6 — стеклянная или металлическая; палочка

раствором полосками хроматографической бумаги, камеру закрывают скользящей крышкой и помещают на подставку с переменным углом. Угол наклона камеры устанавливают равным 7—10°. Камеру оставляют для насыщения на ночь при комнатной температуре.

Убедившись в равномерности слоя сефадекса, наносят микропипеткой по 0,01—0,02 мл растворов (5 мг/мл) исследуемого белка и белков-свидетелей. Для этого пластинку устанавливают горизонтально и наносят белки в отдельные точки на расстоянии 3 см от верхнего края пластинки и друг от друга. Закрывают камеру крышкой и уста118 4

навливают ее под углом /—ш~. i ель-хроматографию проводи! а учение 4—5 ч при комнатной температуре. Затем камеру устанавливают горизонтально, полоски хроматографической бумаги удаляют, пластинку помещают на горизонтальную подставку и снимают реплику на хроматографическую бумагу ватман 3 ММ. Для этого бумагу свертывают в трубочку и, постепенно разворачивая, накладывают на тонкий слой так, чтобы бумага прилипла к нему. Не следует сильно надавливать на бумагу, чтобы не повредить слой сефадекса. Бумагу оставляют на пластинке 1 мин, затем высушивают при 90° С в течение 20 мин и помещают в кювету для окрашивания.

Для идентификации белковых зон реплику помещают на 3—5 мин в раствор бромфенолового синего; краситель отмывают дважды 5%-ным раствором СН3СООН и закрепляют 2%-ным уксуснокислым натрием, приготовленным на 10%-ном растворе СНзСООН. После тщательного промывания в холодной проточной воде хроматографическую -бумагу высушивают и измеряют расстояние, пройденное каждым белком от точки нанесения до центра белкового пятна. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс величину отношения h'lcT (/а — длина пути, пройденного данным белком; / ст — расстояние^ пройден

страница 60
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы кроя химки
костюм от клеща москва
www fissler ru
romana в оренбурге купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(08.12.2016)