химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

дкости устанавливают равной 5 мл/мин.

Приготовление исследуемых белковых растворов. Сыворотка крови. Кровь в количестве 4—6 мл, взятую из уха кролика, обрабатывают, как описано на с. 112. Сыворотка перед употреблением может храниться при низкой температуре (2—4 °С) не более 20 ч.

Сывороточный альбумин лизоцим и другие белки 20— 30 мг растворяют в 1 мл раствора 0,01 М натрий-фосфатного буфера (рН 6,8) и ставят на диализ против того же буферного раствора с двухкратной сменой буфера не менее чем на 4 ч. Проводить диализ более 20 ч не рекомендуется, так как имеется опасность частичной денатурации белка.

Нанесение пробы на колонку. Колонку перед нанесением пробы уравновешивают 8—10 объемами (300—450 мл) исходного буферного раствора (0,01 М натрий-фосфатный буфер, рН 6,8). На поверхность геля наносят 2—3 мл сыворотки крови, разведенной в 2 раза этим же буфером или 2-—3 мл отдиализированного раствора одного из белков. Колонку промывают 0,01 М фосфатным буферным раствором, рН 6,8.

Элюирование белков с колонки и исследование фракций. При работе с колонками, заполненными гидроксилапатитом, рекомендуют ступенчатое повышение ионной силы.

Ku^WivUfU иитин шшригки крови используют следующую серию буферных растворов с постоянной величиной рН (6,8) 8.

1. Натрий-фосфатный буферный раствор 0,01 М — 60 мл.

2. То же 0,06 М — 30 мл.

3. » 0,08 М— 50 мл.

4. » 0.15М— 30 мл.

5. » 0,30 М— 30 мл.

6. Калий-фосфатный буферный раствор 0,70 М—100 мл.

При хроматографировании сывороточного альбумина используют

следующие буферные растворы с рН 6,8 в указанных количествах.

1. Натрий-фосфатный буферный раствор 0,02 М—24 мл.

2. То же 0,07 М—20 мл.

3. » 0,11 М—20 мл.

4. » 0,40 М —30 мл.

Другие белки — линейный градиент буфера 0,1—0,25 М по 75 мл.

Вытекающий из колонки элюат собирают порциями по 3 мл. Содержание белка во фракциях определяют спектрофотометрически по поглощению при 280 нм. Строят профиль элюции белковых фракций (с. 108). Зная количество белка, нанесенного на колонку, рассчитывают относительное содержание белка (в %) в отдельных фракциях.

ЛИТЕРАТУРА

1. С ко у пс Р. Методы очистки белков. М., 1985.

2. Жидкостная колоночная хроматография/Под ред. 3. Дейла, К. Мацека, Я. Яна-ка. М., 1978. Т. 1; Т. 2.

3. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам/Под ред. О. Микеша. М., 1982. Т. 1.

4. Остерман Л. М. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М., 1985.

5. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М., 1976.

6. Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков/Под ред. А. Нидервай-зера, Г. Патаки. М., 1974.

7. Кибардин С. А. Хроматография биополимеров на фосфат-кальциевых гелях// //Усп. химии. 1965. Т. 34, № 8. С. 1472.

8. Детерман Г. Гель-хроматография. М., 1970.

9. Я кубке Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки. М., 1985.

10. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. М., 1980.

П. Методы практической биохимии/Под ред. Б. Уильямса, К. Уилсона. М., 1978.

III. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКОВ

К наиболее распространенным физико-химическим методам определения молекулярной массы белков наряду с седиментационными относятся гель-хроматография (на колонках и в тонком слое), а также электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсуль-фата натрия. Использование этих методов не требует сложной аппаратуры и большого количества исследуемого материала. Получаемые результаты хорошо воспроизводятся и, как правило, коррелируют с данными, полученными другими методами.

1. МЕТОД ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИИ НА КОЛОНКАХ

Принцип метода основан на том, что для большого числа глобулярных белков имеется линейная зависимость между логарифмом мо8 При использовании указанных количеств буферных растворов фонового значе ния оптической плотности не достигается.

лекулярной массы и объемом элюирования с колонки, заполненной гелем с определенной величиной пор. Поэтому для определения молекулярной массы глобулярного белка достаточно определить объем его элюции с предварительно откалиброванной колонки. Калибровку колонки проводят, пропуская через нее белки с известной молекулярной массой и определяя объемы элюции для каждого из них. Объем элюции (Ve) — это объем элюата, собранного с момента внесения вещества на колонку до момента его элюции с колонки, включая фракцию с максимальным его содержанием. Величиной, более стабильной, чем объем элюции (Ve), не зависящей от уровня геля в колонке, является величина Kavгде Ve — объем элюции для данного вещества, Уо — свободный объем колонки, Vt — общий объем колонки.

Реактивы и оборудование см, на с. 106, рис. 12, 13.

Подготовку колонки и проведение процесса хроматографии см. на с. 102. Все операции можно осуществлять при комнатной температуре. После определения свободного объема V0 через колонку последовательно пропускают растворы соответствующих белков-«маркеров» (по 3—4 мг в объеме 0,5—1 мл) 9. Белки удобно наносить последовательно в порядке уменьшения их молекулярной массы с интервалом, зависящим от размера коло

страница 59
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
рекламные костюмы для улицы
Рекомендуем кликнуть и получить скидку в KNS по промокоду "Галактика" - HX428C14SB2K4-32 - федеральный мегамаркет офисной техники.
кресло для телевизора и домашнего кинозала
скамья для душевой

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(07.12.2016)