химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

различающихся по своей специфичности. На долю компонента Б обычно приходится от 10 до 20% от исходного препарата белка. Разделение фракций А и Б осуществляют хроматографи-чески на колонке с КМ-целлюлозой (или на амберлите IRC—50/ХЕ-64).

Реактивы:

1. КМ-целлюлоза фирмы «Ватман».

2. Натрий-фосфатный буфер — 0,01 М раствор, рН 6,0.

3. Натрий-фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 7,5.

4. NaCl — 1 М раствор.

5. НС1 — 0,5 н. раствор.

6. NaOH — 0,5 н. раствор.

. -— v,«j,uuoiDiDaiui и переводи 1 В П^-фОрму (с. 109). Заливают 15 объемами исходного буферного раствора (0,01 М натрий-фосфатный буфер, рН 6,0) и доводят рН полученной суспензии до 6,0 Используют колонку размером 1,5X20 см. Уравновешивание ионита осуществляют тем же буфером.

Препарат рибонуклеазы (15 мг) растворяют в 2 мл исходного буферного раствора и наносят на колонку. Элюцию белка проводят натрий-фосфатным буфером с использованием линейного градиента (с. 104): 150 мл 0,01 М буфера, рН 6,0—150 мл 0,1 М буфера, рН 7,5. Наиболее прочно сорбированные фракции элюируют 1 М NaCl. Элюат собирают порциями по 3—4 мл. Содержание белка определяют при 230 нм.

Обработку результатов см. на с. 108. Рассчитывают процентное содержание белка в отдельных фракциях рибонуклеазы. Регенерируют КМ-целлюлозу.

МЕТОД АДСОРБЦИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Адсорбционная (жидкостная) хроматография находит широкое применение для разделения белков. При этом методе адсорбция фракционируемых соединений на сорбенте происходит под действием межмолекулярных сил.

Из большого числа поверхностно-активных веществ, пригодных в качестве сорбентов при адсорбционной хроматографии, в белковой химии широкое применение получили гели фосфата кальция. В настоящее время в хроматографии белков чаще используют особую форму фосфата кальция—гидроксилапатит (Са50Н(Р04)3). Эта форма более устойчива в широкой области рН и обладает большей стабильностью. Гидроксилапатит готовят смешиванием растворов хлористого кальция и двузамещенного фосфата натрия. Образующийся осадок двузамещен-ного фосфата кальция под действием концентрированной щелочи гид-ролизуется в новую разновидность фосфата кальция — гидроксилапатит.

Разделение белков сыворотки крови на колонке с гидроксилапа-титом

Приготовление гранулированного гидроксилапатита. Метод основан на кристаллизации гидроксилапатита в присутствии дополнительных центров кристаллизации, в данном случае частиц кремневой кислоты.

Реактивы:

1. СаСЬ — марки х. ч. — 0,5 М раствор.

2. Na2HP04 — 0,5 М раствор. 3 Силикагель — 15—20 мкм.

4. NaOH — 40%-ный раствор.

5. Натрий-фосфатный буфер — 0,01 М и 0,02 М растворы, рН 6,8.

Порошок силикагеля (0,5 г) суспендируют в 25 мл дистиллированной воды, оставляют до полного его набухания. Набухший гель дважды промывают водой, удаляя избыток жидкости декантацией. Промытый осадок переносят в стеклянный сосуд-смеситель, содержащий

100 мл воды. В этот сосуд одновременно с помощью двух перистальтических насосов приливают по 0,5 л 0,5 М раствор СаС32 и 0,5 М раствор Na2HP04 со скоростью 0,5—0,6 мл/мин. При этом смесь тщательно и осторожно перемешивают механической мешалкой. Образовавшийся осадок после 30-минутного выстаивания промывают 4 раза водой, каждый раз удаляя избыток жидкости декантацией. Затем промытый осадок суспендируют в 1 л воды и к суспензии добавляют 25 мл 40%-ного раствора NaOH. Смесь нагревают на кипящей водяной бане до 96— 98 °С и выдерживают при этой температуре в течение часа. Чтобы избежать местного перегрева и разрушения кристаллов геля, смесь во время нагревания периодически осторожно перемешивают вручную. После нагревания осадку дают отстояться, жидкость над осадком, не дожидаясь ее охлаждения, декантируют, а осадок промывают (4—5 и более раз) дистиллированной водой (по 1 л) до достижения нейтральной реакции среды в промывных водах. Время осаждения кристаллов при этом 10 мин. Промытый осадок суспендируют в литре 0,01 М натрий-фосфатного буферного раствора (рН 6,8) и нагревают на кипящей водяной бане до 96—98 °С. Жидкость над осадком декантируют, а к осадку приливают новую порцию (1 л) буфера и полученную смесь инкубируют в течение 5 мин при 96—98 °С. Снова заменяют новой порцией этого же буфера и нагревают полученную суспензию в тех же условиях еще 15 мин. Надосадочную жидкость отсасывают. Полученный гидроксилапатит осторожно суспендируют в 0,01 М растворе натрий-фосфатного буфера (рН 6,8) и через 10 мин жидкость над гелем декантируют. Операцию повторяют трижды. После этого гель суспендируют в небольшом объеме 0,01 М раствора натрий-фосфатного буфера (рН 6,8) и хранят в виде густой суспензии при низкой температуре (2—5°С).

Колонку размером 2X20 см подготавливают так, как это описано на с. 101, и заполняют густой взвесью геля фосфата кальция до тех пор, пока высота столба геля не достигнет 15 см. Необходимо, чтобы верхний слой геля имел гладкую горизонтальную поверхность. Колонку соединяют с резервуаром, заполненным 0,01 М фосфатным буферным раствором, рН 6,8. Скорость тока жи

страница 58
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить новогоднюю композицию в дом
дачный участок на новорижском шоссе
где моно отучится на мужского парикмахера в москве мо
Хлебницы Konig купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(04.12.2016)