химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

скоростью 5—6 капель в 1 мин) до тех пор, пока рН выходящего из колонки раствора не будет равен исходному. Количество раствора, не6 Если ДЭАЭ-целлюлозу используют не сразу, ее заливают водой и хранят при 4°С с добавлением следовых количеств толуола.

ш

u„avrt"»'«iv /v'n л^аппиошнпапия, LUCI авляет окили о оощих ооъемоВ

КОЛОНКИ.

Подготовка и нанесение исследуемого материала. Получение сыворотки крови см. на с. 90. Для удаления солей ее диализируют против исходного буферного раствора. Для этого сыворотку разводят в два раза исходным буферным раствором, помещают в диализный мешочек и диализируют против того же буфера в течение не менее 12 ч (можно оставлять на ночь). В отдиализированном растворе определяют содержание белка и наносят на колонку 50—100 мг белка в объеме 1—3 мл. Колонку промывают исходным буферным раствором до тех пор, пока оптическая плотность не станет равной примерно 0,05.

Элюирование белков. Скорость протекания растворов через колонку не должна превышать 15—20 мл/ч. Элюат собирают порциями по 3 мл. Элюирование белков с колонки проводят буферными растворами с линейным градиентом NaCl, меняя концентрацию последнего от 0 до 0,3 М (прибор для создания линейного градиента см. на рис. 14). В смеситель помещают 250 мл 0,02 М натрий-ацетатного буфера (рН 5,65), а в резервуар (сосуд 1) — 250 мл этого же раствора, но содержащего 0,3 М NaCl. Наиболее прочно адсорбированные белки дополнительно элюируют 0,5 М раствором NaCl в 0,5 М ацетатном буфере (рН 5,65).

Содержание белка определяют спектрофотометрически при 280 нм. На основании данных, полученных при определении содержания белка в отдельных порциях элюата, строят профиль элюции (с, 108). Рассчитывают процентное содержание белка в отдельных фракциях.

Для идентификации белков, элюируемых с колонки, содержимое пробирок, соответствующее отдельным пикам на кривой элюции, объединяют, подвергают диализу, лиофилизируют и исследуют с помощью электрофореза на бумаге или в полиакриламидном геле.

Разделение белков сыворотки крови на КМ-целлюлозе

КМ-целлюлоза — слабый катионит. Содержит в качестве ионоген-ных групп карбоксиметильные остатки —СН2—СОО-, связанные с гид-роксильными группами целлюлозы эфирными связями. Используется для разделения основных и нейтральных белков.

R—СОО-Н+ (Na+) +X+=^R—СОО-Х+ + Н+ (Na+).

Фракционирование белков сыворотки крови на КМ-целлюлозе рекомендуется проводить путем создания ступенчатой элюции. Это обусловлено достаточно большими различиями в сродстве отдельных белковых фракций к иониту. Сорбция белков на колонке осуществляется при рН 4,6 («стартовый» буфер). При таком значении рН белки сыворотки крови сорбируются на слабых катионитах.

Реактивы:

1. НС1 — 0,5 н. раствор.

2. NaOH — 0,5 н. раствор.

3. КМ-целлюлоза 7.

j . " ~ J ~t—Г — - - г * Г > 1 -, —.

5. Натрий-ацетатный буфер — 0,05 М раствор, рН 5,2.

6. Натрий-ацетатный буфер — 0,08 М раствор, рН 6,0.

7. Фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 7,0.

8. Фосфатный буфер — 0,1 М раствор, содержащий 0,5 М NaCl рН 8,3.

Подготовка сорбента. Около 10 г КМ-целлюлозы обрабатывают и переводят в Н+-форму (с. 109). Гранулярную или волокнистую целлюлозу рекомендуется отмывать после обработки кислотой или щелочью фильтрованием на воронке Бухнера или центрифугированием. Сферическую КМ-целлюлозу, которая оседает очень быстро, можно отмывать декантацией в химическом стакане. В случае необходимости КМ-целлюлозу фракционируют по размеру частиц (с. ПО).

Подготовка и заполнение колонки с размером 1,5x10 см описаны на с. 102. Исходный («стартовый») буферный раствор — 0,02 М натрий-ацетатный буфер, рН 4,6.

Подготовка и нанесение исследуемого материала. Сыворотку крови (получение см. на с. 90) для удаления солей диализируют против исходного буферного раствора в течение суток. В диализированном растворе определяют содержание белка и в количестве 70—100 мг наносят его на колонку. Колонку промывают исходным буферным раствором до тех пор, пока оптическая плотность элюата не станет равна 0,02.

Фракционирование белков сыворотки крови на КМ-целлюлозе осуществляют с помощью ступенчатого элюирования, подавая на колонку последовательно следующие растворы: 0,02 М натрий-ацетатный буфер, рН 4,6 («стартовый» буфер), затем 0,05 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,2; 0,08 М натрий-ацетатный буфер, рН 6,0; 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0 и, наконец, 0,1 М фосфатный буфер, содержащий 0,5 М NaCl, рН 8,3. Каждый новый раствор подают на колонку только после того, как полностью элюируется пик, вымываемый предыдущим раствором. Скорость тока приблизительно составляет 50 мл/ч. Элюат собирают порциями по 2—3 мл. Обработку результатов см. на с. 108. Идентификацию белков осуществляют методом электрофореза на бумаге или в полиакриламидном геле (с. 112). Регенерацию КМ-целлюлозы проводят вне колонки.

Хроматография рибонуклеазы на КМ-целлюлозе

Коммерческие препараты панкреатической рибонуклеазы негомогенны. Они состоят из двух основных компонентов А и Б, с близкой структурой и свойствами, но

страница 57
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ремонт холодильника обучение
протезирование зубов виды и цены в клину
цирк в москве в январе 2018
комплект садовой мебели поляна акция

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(14.12.2017)