химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ермостате при 60—80 °С.

МЕТОД ИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОЕРАФИИ

В основе разделения соединений методом ионообменной хроматографии лежат реакции ионного обмена между анализируемыми соединениями и сорбентами-ионитами, имеющими в своем составе ионизируемые группировки.

Сильные иониты, функциональные группы которых образованы сильными кислотами или основаниями, могут быть ионизированы полностью во всем диапазоне рабочих значений рН (3—11). Слабые иониты, функциональные группы которых образованы слабыми кислотами или основаниями, могут быть ионизированы не полностью и лишь в ограниченной области значений рН.

При фракционировании белков методом ионообменной хроматографии большое внимание уделяют выбору ионообменника (природе матрицы и емкости ионита) и буферного раствора, при котором осуществляется сорбция белков (величине рН и ионной силы, природе буфера и буферной емкости).

При работе с белками в качестве сррбентов используют иониты, обладающие высокой степенью гидрофильности.

Белки могут быть разделены как на катионитах, так и на аниони-тах. Выбор типа ионита определяется изоэлектрическими точками хроматографируемого материала и устойчивостью белка в определенной зоне значение рН.

Эффективная сорбция белков происходит при значениях рН, отсто* ящих не менее чем на единицу от pi. В области pHр1+1 — на янионитах. Изменение рН в направлении к ИЭТ способствует десорбции белков. При работе с белками используют буферные растворы с низкой ионной силой, но высокой буферной емкостью. Для этого пользуются буферными растворами, рК которых отстоит от величины рН, используемой в эксперименте, не более чем на 0,3—0,5 единиц рН. Хроматографию на анионитах ведут в таких системах, где диссоциируемым компонентом является катион (буферы: трис, пиридин, имидазол и др.), я для катионитов диссоциируемым компонентом является анион (ацетатный, фосфатный, бикарбонатный буфер и др.).

При ионообменной хроматографии смесь белков сорбируется в верхней части колонки и затем вытесняется веществами, уменьшающими их сорбцию на ионите. Понижение сорбции осуществляют повышением ионной силы раствора и (или) изменением его рН. Изменение рН и ионной силы элюирующего буферного раствора можно проводить путем создания ступенчатой или градиентной элюции (с. 104).

Подготовка ионообменников к работе. Использованию ионитов для хроматографического разделения белков предшествует их предвари-^ тельная обработка. Иониты промышленного изготовления после набухания, во-первых, фракционируют по размеру частиц (однородность частиц сорбентов по размеру — одно из важных условий успешной хроматографии) и, во-вторых, подвергают «циклизации» — переводу их из «одной формы в другую. Катиониты переводят из Ш+-формы в Н+-фор-му или наоборот, а аниониты — из СГ~-формы в ОН--форму или наоборот. В процессе такой обработки стабилизируется структура ионита и функциональные группы становятся более доступными. Одновременно ионит освобождается от примесей.

5 На всех стадиях обработки ионита фильтрование может быть заменено декантацией или центрифугированием.

Навеску порошка сорбента суспендируют в 50-кратном и более объеме дистиллированной воды, перемешивают и оставляют набухать на ночь. Слой жидкости над ионообменником декантируют, снова заливают дистиллированной водой, перемешивают и через 2—2,5 ч верхний слой жидкости декантируют вместе с неосевшими мелкими частицами. К оставшемуся осадку приливают 50-кратный объем 0,5 н. NaOH, тщательно перемешивают и через час ионит фильтруют через воронку Бух-нера 5. Осадок на воронке промывают водой до рН 7,0. Затем ионит перемешивают в 50-кратном объеме 0,5 н. НС1 и через 30—60 мин (время обработки ионита кислотой не должно быть большим) отмывают дистиллированной водой примерно до рН 5,0. На следующем этапе в случае анионитов, например ДЭАЭ-целлюлозы, сорбент повторной обработкой щелочью переводят в ОН~-форму. Для этого его суспендируют в 50-кратном объеме 0,5 н. NaOH, перемешивают и через час отмывают дистиллированной водой до рН воды. В случае катионитов, например КМ-целлюлозы, сорбент повторной обработкой кислотой переводят в Н+-форму. Для этого его суспендируют в 50-кратном избытке 0,5 М раствора НС1 в течение 30—60 мин. После фильтрования сорбент отмывают дистиллированной водой до тех пор, пока рН промывной жидкости не достигнет рН воды.

v^ww/rvAcrmK ui мелких и крупных частиц ионит суспендируют в цилиндре на 1 л, перемешивают, отстаивают 20—30 мин и верхний слой жидкости с неосевшимй мелкими частицами декантируют. Эту операцию повторяют несколько раз {5—6), пока жидкость над осадком будет свободной от мелкой взвеси. Чтобы освободиться от крупных частиц, ионит суспендируют в воде, перемешивают и через ~ 1 мин суспензию сливают в другой цилиндр.

После описанной обработки ионит уравновешивают буферным раствором, в котором осуществляют сорбцию белков на ионообменнике (исходный буферный раствор). Эту процедуру можно проводить как на колонке, так и вне ее

страница 55
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
монитор samsung c27fg73fqi
гостиницы в германии
132132b0101
брюки спортивные (парадные) в москве купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(18.12.2017)