химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

нтрирования обычно используют сефадексы U-2b и О-ьи (груоьщ или средний). При разделении же смеси белков пользуются сефадексами тонкого или сверхтонкого зернения. Чем мельче частицы геля, тем эффективнее происходит разделение, но тем меньше скорость протекания раствора через колонку.

При работе сефадексам дают предварительно набухнуть в избытке растворителя. Время и температура набухания указаны в соответствующих таблицах.

Реактивы:

1. Натрий-фосфатный или калий-фосфатный буфер — 0,05 М растворы, содержащие 0,05 М KQ, рН 6,5.

2. Сефадекс G-100.

3. Белки с определенной молекулярной массой (Да): яичный альбумин (45 000), бычий сывороточный альбумин (68 000), рибо-нуклеаза из поджелудочной железы (12 700), цитохром с (13 000).

4. Голубой декстран (м. м.—2 000 000 Да).

5. Сахароза.

Разделение белков на колонках с сефадексом. Сухой сефадекс суспендируют в 200-кратном объеме воды и оставляют стоять на 48 ч при комнатной температуре для полного набухания. Набухание можно ускорить, проводя его на кипящей водяной бане в течение 5 ч.

Колонку (размером 1,5X50 см) 3 подготавливают так, как описано на с. 103. В нее вносят относительно густую суспензию полностью набухшего геля. Для предотвращения образования пузырьков воздуха в слое геля в колонке суспензию сефадекса перед заполнением колонки можно деаэрировать с помощью водоструйного насоса в колбе Бунзе-на или вносить его в колонку при температуре, значительно превышающей комнатную (50—60 °С). Сефадексу в колонке дают отстояться, затем с целью уравновешивания и достижения постоянной высоты столба геля колонку промывают 3—5 объемами буферного раствора. Гидростатическое давление для сефадекса G-100 не должно превышать 50 см: /i=20—50 см (давление при разделении образца и при заполнении колонки должно быть одинаковым). Для проверки равномерности заполнения через колонку можно пропустить раствор окрашенного белка, например цитохрома с или голубого декстрана. При этом окрашенная зона должна быть компактной и двигаться по колонке параллельно ее основанию.

Исследуемую белковую смесь растворяют в буферном растворе в объеме 1 мл 4 (по 2—4 мг каждого белка) и вносят в колонку. Нанесение пробы на колонку проводят, как описано на с. 104, увеличив плотность раствора добавлением сахарозы до 0,5 М.

3 Для аналитических целей рекомендуется отношение длины к диаметру колонки 10:1 или 20:1. При обессоливании используют более короткие и широкие колонки.

4 Объем наносимого образца при аналитическом разделении должен быть по возможности небольшим (2—3% от общего объема колонки—Vt). При обессоливании его можно увеличить до 20—30%. Рекомендуемая концентрация белка—1%. При анализе высокомолекулярных белков концентрацию уменьшают до 0,1—0,5%.

Перед использованием колонки определяют ее свободный объем (Vo). Для этого через колонку пропускают 1 мл (1 мг/мл) раствора голубого декстрана в 0,5 М растворе сахарозы. В качестве растворителя как для голубого декстрана, так и для исследуемых белков применяют тот же буферный раствор, которым уравновешена колонка. Им же элюируют белки с колонки после нанесения анализируемой смеси. Следует отметить, что поскольку положительно заряженные частицы могут частично взаимодействовать с сефадексом (за счет имеющихся карбоксильных групп), для элюции обычно используют растворы с ионной силой выше 0,02. Если исследуемые белки после гель-хроматографии надлежит лиофилизировать, для элюции используют летучие буферные растворы (аммоний бикарбонатный, ацетатный, формиатный и др.).

Вытекающий из колонки буферный раствор собирают в пробирки порциями по 1—3 мл. Регистрацию объема элюата, прошедшего через колонку, начинают с момента нанесения образца на колонку. Содержание белка во фракциях определяют спектрофотометрически при 280 нм. Оптическую плотность растворов, содержащих рибонуклеазу, определяют при 230 нм, голубой декстран — при 650 нм, цитохром с — при 412 нм. После окончания анализа колонку промывают несколькими объемами буферного раствора. Строят профиль элюирования отдельных белковых фракций. Для этого вычерчивают график, на горизонтальной оси которого откладывают номера пробирок (фракций) или объем прошедшей через колонку жидкости, а на вертикальной оси — величины оптической плотности фракций.

Регенерация и хранение сефадекса. Многократное использование колонки с сефадексом приводит к замедлению протекания жидкости через нее. В этом случае гель извлекают из колонки, отмучивают его от мелких частиц и колонку набивают заново.

Сефадексы можно хранить в виде суспензии или в сухом виде. Суспензию сефадекса следует хранить в холодильнике в присутствии антисептиков: 0,02%-ного азида натрия, мертиолата или хлороформа. Для переведения геля в сухое состояние сефадекс сначала промывают водой для удаления солей, а затем выдерживают несколько минут с 2-кратным объемом 50%-ного этанола; после фильтрования на воронке Бухнера сефадекс выдерживают с 2-кратным объемом 96%-ного этанола. Обработку последним повторяют несколько раз. Осадок высушивают в т

страница 54
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
wizardfrost.ru
шашка на крышу автомобиля белая
крышка пресс для цыпленка табака
изготовление вывесок на фасад здания

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(27.04.2017)