химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

лобин (pi 6,8—7,0), РНКаза (pi 7,8), а-химотрипсин (р18,1), папаин (pi 9,0), лизоцим (pi 10,5), цитохром с (pi 10,0).

9. Красители с известными изоэлектрическими точками; патентованный синий V (pi 3,0), малахитовый зеленый FCF (pi 3,05 и pi 3,85), метиловый синий (pi 3,60), конго красный (pi 5,8).

Для приготовления 2 мл геля, достаточного для заполнения одной, трубки при электрофокусировании, смешивают 0,4 мл раствора № 1, 0,1 мл 40%-ного раствора амфолитов широкого диапазона рН (рН 3— 9 или рН 2—11), 0,5 мл раствора сахарозы (раствор сахарозы можно заменить водой) и 0,9 мл воды. Смесь помещают в колбу для деаэрирования. После 5—10-минутного деаэрирования в полученную смесь добавляют 0,1 мл раствора исследуемого белка или белка с известной изоэлектрической точкой. Концентрация белка — 0,3—1 мг/мл. В качестве стандартов с известными изоэлектрическими точками можно использовать перечисленные выше красители. В этом случае вместо белка в образец вносят 0,1 мл водного раствора красителя (или смесь нескольких красителей) с концентрацией 0,03—0,08 мг/мл. К полученному раствору (2 мл) добавляют 10 мкл раствора ТЕМЕД (конечная концентрация 0,05%) и 2 мкл раствора персульфата аммония (конечная концентрация 0,04%). Полученную смесь немедленно заливают в трубочки с внутренним диаметром 3—5 мм и длиной 8—10 см, установленные в специальной подставке (см. рис. 10). Сверху на этот раствор осторожно наслаивают воду. После окончания полимеризации трубочки вставляют в верхнюю электродную камеру прибора для электрофореза (см. рис. 10). Обычно используют полиакриламидные гели низкой концентрации (5—6%), которые имеют тенденцию выскальзывать из трубки. Чтобы этого не произошло, нижний конец трубки закрывают целлофановой мембраной, которую закрепляют на трубке с помощью резинового кольца. В верхнюю камеру прибора заливают 0,5 М раствор NaOH, в нижнюю камеру — 0,5 М раствор Н3РО4. Вставляют электроды так, чтобы в верхнем сосуде располагался катод, а в нижнем — анод, и подключают к источнику пита ниягС начал а ток на каждую трубку должен составлять 1 мА. По мере фокусирования из-за возрастания сопротивления напряжение увеличивают. Когда оно достигнет 250— 300 В, источник питания переключают в режим стабилизации напряжения и поддерживают его равным 300 В в течение 3—5 ч. Об окончании фокусирования судят по миграции и концентрированию зон красителей с известными изоэлектрическими точками или по движению зон окрашенных белков (цитохром с, гемоглобин, каталаза), Изоэлект-рофокусирование проводят на холоде.

Образцы белка также можно наносить на предварительно полиме-ризованные гели. После полимеризации гели можно подвергнуть предварительному фокусированию (1 мА на трубку, 30—60 мин). Затем источник тока отключают и на поверхность геля наслаивают 30—80 мкл образца белка (30—100 мкг белка в расчете на одну зону), растворенного в смеси, содержащей 20% сахарозы и 2% амфолитов, предварительно оттитрованных до рН 8—9. Далее проводят электрофокусирование, как это было описано выше. Такой метод нанесения образца можно использовать и при фокусировании с использованием вертикально расположенных пластин полиакриламида (с. 97).

После окончания электрофокусирования гели извлекают из трубок. Часть гелей прокрашивают для выявления белковых зон, а один или два геля используют для измерения градиента рН, сформированного в ходе изоэлектрофокусирования. Существует много вариантов окраски гелей. Один из них состоит в том, что гели погружают на 1 ч в 0,075%-ный раствор кумасси G-250 в 3,5%-ном растворе НС104. Затем гели 3— 5 раз промывают 3,5%-ным раствором НС104 и в нем же хранят. Белки выявляются в виде синих полос на слабо-желтом фоне. Для определения рН на гелях существует несколько методов. Градиент рН можно определить, измерив положение маркеров-красителей или маркеров-белков с известными изоэлектрическими точками. Другой способ состоит в том, что гель разрезают поперек на диски толщиной 2—4 мм. Эти диски помещают в пробирки и заливают минимальным объемом (1—3 мл) прокипяченной бидистиллированной воды. Пробирки продувают инертным газом, закрывают пробками со шлифом и оставляют при комнатной температуре на 10—12 ч. За это время амфолиты диффундируют из геля, поэтому, измерив рН в каждой пробирке, можно определить градиент рН на геле. Зная градиент рН и положение белка на геле, определяют изоэлектрическую точку исследуемого белка.

ЛИТЕРАТУРА

1. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование М., 1981.

2. Га а ль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М., 1982.

3. О с т е р м а н Л. А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М., 1983.

4. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М„ 1976.

5. Прусик 3. Электромиграционные методы//Лабораторное руководство по хро-матографическим и смежным методам/Под ред. О. Микеша. М., 1982. Т. 2. С. 679.

6. Скоупс Р. Ме

страница 51
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
где обучают обслуживанию газовых водонагревателей
где купить шашку для такси
пусконаладка чиллера vertro
Комплект постельного белья 120*60 7 предметов Bombus

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(30.05.2017)