химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

аккуратно отделяют одно стекло от другого и переносят пластину геля в плоскую кювету или пластмассовую коробку. Для фиксации,, прокраски и обесцвечивания используют те же растворы, как и в случае цилиндрических гелей. Время прокраски уменьшают в два раза.

АНАЛИТИЧЕСКОЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ БЕЛКОВ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Изоэлектрофокусирование — один из вариантов электрофоретиче-ского разделения макромолекул. Принцип метода состоит в следующем. Если на колонку, вдоль длины которой сформирован градиент рН, нанести образец белка, а потом подключить концы колонки к источнику тока, то молекулы белка будут двигаться по колонке до тех пор, пока не достигнут той области, где величина рН окажется равной величине изоэлектрической точки белка. Для создания градиента рН используются сложные смеси амфотерных соединений, по-разному обозначаемые-фирмами-изготовителями (например, амфолины, фармалиты, сервали-ты и т. д.). Эти соединения обычно имеют небольшую молекулярную массу (400—800 Да) и получаются путем химического синтеза. Общая формула некоторых типов амфолитов может быть представлена в виде:

__СН,—N—(CH2)n—N—СН2 I !

№)„ R I

N

/ \ R R

На месте R могут стоять:Н, -(СН2)„ГСООН, -<СНЯ)ЯSOJH, -(CH2)„P03H2; я<5.

Величина рК амфолитов варьирует от 2,5 до 11. Изоэлектрические-точ*ки некоторых из них отличаются друг от друга не более чем на 0,05 единиц рН. Смесь амфолитов помещают в колонку, заполненную

крупнопористым гелем или концентрированным расширим ^ала^лы. Один конец колонки погружают в разбавленный раствор щелочи, куда опускается один электрод (катод), а другой конец колонки помещают в разбавленный раствор кислоты, куда опускается другой электрод (анод). В начале все амфолиты распределены равномерно по объему колонки. При подключении электрического тока амфолиты, имеющие изоэлектрические точки при кислых значениях рН и располагающиеся у катода, депротонируются, приобретают большой отрицательный заряд и начинают двигаться к аноду. В то же время амфолиты, расположенные около анода и имеющие изоэлектрические точки при щелочных значениях рН, протонируются, приобретают положительный заряд и движутся к катоду. Значения рН используемых растворов щелочи и кислоты соответственно выше и ниже величин pi самых «щелочных» и -самых «кислых» амфолитов. Вследствие этого по мере приближения к электродам все амфолиты проходят такую область геля, где рН оказывается равным изоэлектрической точке амфолитов. В этой области суммарный заряд амфолитов становится равным нулю и они перестают передвигаться к электродам. Накопление амфолитов, обладающих одним и тем же pi, в одной зоне приводит к созданию мощного буфера, способного поддерживать рН, равный изоэлектрической точке этой группы амфолитов. После того как все амфолиты достигнут соответствующих областей, на геле создается устойчивый градиент рН, крутизна, форма и стабильность которого определяются концентрацией и диапазоном pi используемых амфолитов, а также составом и концентрацией приэлектродных растворов. Если формирование градиента рН происходит в присутствии белка, суммарный заряд молекулы которого определяется соотношением кислых и щелочных аминокислот, или если белок наносят на уже сформированный градиент рН, то молекулы белка ведут себя так же, как и молекулы амфолитов. Вследствие этого после окончания процесса изоэлектрофокусирования белки концентрируются в виде очень узких зон, положение которых определяется изоэлектрической точкой белка.

При изоэлектрофокусировании белок можно наносить на любую точку предварительно сформированного градиента рН или формировать градиент рН в присутствии белка. В начальные периоды фокусирования электрический ток имеет достаточно большую величину. По мере фокусирования он уменьшается и к концу фокусирования достигает какой-то минимальной величины. Охлаждение обеспечивает получение более четких и узких зон белка. Увеличение времени электрофо-жусирования не сопровождается размыванием белковых зон.

Реактивы:

1. Раствор для приготовления геля. Акр ил амид (24 г) и метиленбисакриламид (1 г) растворяют в воде и доводят объем водой

до 100 мл. Раствор хранят в темной склянке на холоде. При изоэлектрофокусировании необходимо использовать высокоочищенные препараты всех реактивов, особенно акриламида.

Внимание! Работу с акриламидом проводят под тягой, в перчатках!

2. Амфолиты — 20- или 40%-ный растворы.

3. Персульфат аммония — 40%-ный раствор (свежеприготовленный) .

4. ТЕМЕД — 10%-ный раствор.

5. Сахароза — 40%-ный раствор.

6. NaOH — 0,5 М раствор и Н3Р04 — 0,5 М раствор.

4*

99

_ —j . — о 70-ныи pdcibop в I3,o7o-hom paстворе НСЮ4.

Необходимую навеску красителя суспендируют в нужном объеме 3,5%-ного раствора НСЮ4 и перемешивают на магнитной мешалке в течение часа при комнатной температуре, затем фильтруют через бумажный фильтр и хранят при комнатной температуре.

8. Белки с известными изоэлектрическими точками: сывороточный альбумин (pi 4,6), овальбумин (pi 4,6), катал аза (pi 5,7), гемог

страница 50
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
железобетонные изделия жби
напольная вешалка для одежды в леруа мерлен
шумоглушитель sg 70-40 характеристики
установка приточно-вытяжная shuft unimax-p 3000cw ec

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(26.09.2017)