химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

мешает четкому разделению белков, поэтому такие растворы следует предварительно обессолить.

После нанесения образцов белка в трубочки наслаивают электродный буфер, затем заливают буфер в верхний резервуар. При использовании щелочных буферных растворов в них добавляют раствор бром-фенолового синего из расчета 0,5—1 мл красителя на 500 мл раствора, а в случае кислых буферов — метиленовый зеленый. Краситель маркирует движущийся пограничный слой во время электрофореза.

Аппарат для электрофореза подключают к соответствующим полюсам источника постоянного тока, учитывая величины изоэлектричес-ких точек разделяемых белков и рН буферной системы. При исследовании лабильных белков аппарат помещают в холодильник. В первые 5—10 мин электрофорез проводят при силе тока 1,5—2,0 мА на трубочку, затем силу тока увеличивают до 4—5 мА. Электрофорез заканчивают, когда окрашенная полоса до^ггиТнет нижнего конца трубочки 1.

1 В некоторых случаях перед разделением опытных смесей до добавления белка предварительно проводят электрофорез, при котором удаляются побочные продукты полимеризации, которые могут ухудшить электрофоретическое разделение, а также персульфат аммония, который ингибирует активность некоторых ферментов Условия предварительного электрофореза сила тока — 3—5 мА, напряжение — 200—400 В, продолжительность — около 60 мин

После завершения электрофореза прибор отключают от источника тока, сливают буферный раствор, трубочки вынимают из прибора и с помощью стальной иглы (под слоем воды) или водой, вводимой шприцом между поверхностью геля и стенкой трубочки, выталкивают столбик геля в 7%-ный раствор уксусной кислоты. Столбики геля помещают в пробирки и добавляют раствор красителя амидового черного 10 Б. Время окрашивания 5—10 мин, В качестве красителя можно использовать кумасси R-250. В этом случае прокрашивают 1—2 ч при комнатной температуре. После окрашивания избыток красителя отмывают 7%-ным раствором уксусной кислоты, цилиндрики геля сохраняют в том же растворе кислоты.

Вертикальный электрофорез в пластине

Электрофорез белков в пластине полиакриламидного геля имеет ряд преимуществ по сравнению с электрофорезом в трубочках. Использование тонких пластин облегчает эффективное отведение тепла при электрофорезе. Процесс фиксации, прокраски и отмывания занимает значительно меньше времени. Использование одной пластины позволяет

в абсолютно идентичных условиях проводить разделение сразу нескольких (10—13) проб белка. На пластины можно наносить меньше белка, чем на цилиндрические гели. В зависимости от используемого красителя, а также от природы белка на пластине полиакриламида удается обнаружить от 5 до 50 мкг белка.

В приборе, изготовляемом производственным объединением «Хийу Калур» Эстонской ССР, гель полимеризуют в специальной гелевой ячейке-кассете (рис. 11, Л, 5). Для ее создания в выполненную из пластика рамку вставляют два стекла. Зазор между стеклами можно регулировать специальными прокладками толщиной 1, 2 или 3 мм, задающими толщину пластины полиакриламида. Стекла плотно вставляют в рамку и ячейку герметизируют с помощью специальных прокладок из силиконовой резины. В зазор между стеклами заливают смесь для полимеризации (см. с. 95). Если разделение проводят в геле только одного типа, раствор заливают в кассету доверху и сразу же между стеклами вставляют специальную пластинку — «гребенку». Зубцы ее образуют углубления на поверхности геля, в которые впоследствии вносят образцы белка. Если в работе используют два типа гелей (концентрирующий и разделяющий), то в кассету сначала на высоту 85—95 мм от дна заливают раствор для полимеризации разделяющего геля. На него осторожно наслаивают воду и кассету оставляют в вертикальном поло4 Зак 41G

97

mvuun и^щщс^иаации геля, коду удаляют, на поверхность разделяющего геля наносят смесь для полимеризации концентрирующего геля до полного заполнения кассеты и вставляют шаблон-гребенку. После окончания полимеризации удаляют одну из герметизирующих прокладок (см. инструкцию к прибору), вынимают из геля шаблон-гребенку и вставляют ячейку в прибор. Контакт между электродными отсеками (1) в приборе (они расположены с двух сторон от гелевой ячейки) осуществляется через пластинку полиакриламида, верхний конец которой контактирует с правым электродным отсеком, а нижний конец — с левым электродным отсеком (рис. 11,5). После сборки прибора электродные камеры заполняют буферным раствором, а в лунки-колодцы на поверхности геля тонко оттянутым капилляром из стекла или из тефлоновой или полиэтиленовой трубочки наносят образцы белка. Необходимо, чтобы плотность образцов белка была выше плотности буферного раствора. Поэтому раствор белка готовят на 10%-ном растворе сахарозы. После нанесения образца прибор подключают к источнику тока и проводят электрофорез. После того как маркерный краситель, вносимый с образцом белка, достигнет нижней границы пластины, источник питания выключают, сливают электродные буферы и вынимают гелевую ячейку. Из ячейки вынимают уплотнительные прокладки,

страница 49
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
11265-01-20g
подарочной сертификат билеты в театр
история любви купить билеты
системная склеродермия обследование

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(15.12.2017)