химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Метод обладает большой разрешающей способностью в связи с тем, что разделение белковых смесей идет не только по заряду, но и по размерам и форме частиц. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет ряд преимуществ: химическая стабильность и инертность геля, возможность получения гелей с заданной величиной пор, отсутствие адсорбции и электроосмоса, устойчивость к растворителям, изменениям температуры и рН.

Использование диск-электрофореза в полиакриламидном геле, т. е. электрофореза в неоднородной разделяющей среде, добавляет к этому эффект концентрирования, что позволяет проводить разделение белков из разбавленных растворов без их предварительного концентрирования.

Электрофоретическое разделение белков проводят как в трубочках, так и в тонком слое полиакриламидного геля (слэбе).

Реактивы:

1. ТЕМЕД — реактив стабилен при хранении в холодильнике в неразбавленном виде. К полимеризуемой смеси его добавляют непосредственно перед разливкой.

2. Персульфат аммония [(NH4)2S20s]—1%-ный раствор, свежеприготовленный.

3. Амидовый черный 10 Б —0,5%-ный раствор в 7%-ной СН3СООН.

Раствор стабилен при комнатной температуре.

4. Кумасси R-250 — 0,1%-ный раствор, приготовленный на 7%-ном растворе СН3СООН.

5. СНзСООН — 7%-ный раствор.

6. Сахароза — 40%-ный раствор.

Реактивы для разделения белков с pl<7,5

7. Электродный буферный раствор, рН 8,3; 6,0 г триса и 28,8 г глицина растворяют в воде и доводят до 1 л. Раствор стабилен при хранении в холодильнике. При использовании в работе основной раствор разбавляют в 10 раз.ь

8. Буферный раствор для приготовления геля, рН 8,9. К 36,3 г триса добавляют 48 мл 1 н. раствора НС1 и объем доводят водой до 100 мл. Раствор стабилен.

9. Раствор акриламида: 28 г акриламида и 0,735 г 1Ч,Г\Г-метилен-бисакриламида растворяют в 100 мл воды (сначала растворяют метилен-бисакриламид, затем акрил амид); раствор стабилен.

10. Бромфеноловый синий — 1 мг в 100 мл воды.

Реактивы для разделения б е л к о в с pl>7,5

1''. Электродный буферный раствор, рН 4,5: 31,2 г (3-аланина и 8 мл ледяной уксусной кислоты доводят водой до 100 мл; перед использованием разбавляют в 10 раз.

8'. Буферный раствор для приготовления геля, рН 4,3: 48 мл 1 н. раствора КОН смешивают с 17,2 мл ледяной уксусной кислоты и доводят водой до 100 мл.

9'. Раствор акриламида: 60,0 г акриламида и 0,4 г метиленбисак-риламида растворяют в 100 мл воды.

ал

10'. Метиленовый зеленый — 0,1%-ный раствор. Внимание! Акриламид токсичен. Работу проводят под тягой, в перчатках!

Электрофорез в трубочках

Для проведения электрофореза можно использовать прибор фирмы «Реанал» (описание к прибору прилагается). Прибор (рис. 10) состоит из двух резервуаров для буферных растворов емкостью 1,5 л.

В центре резервуаров в специальных держателях закреплены электроды. В дне верхнего резервуара имеются отверстия для стеклянных трубочек, которые укрепляются зажимными кольцами с резьбой (прилагаются к прибору вместе с конусными и резиновыми кольцами-прокладками). Для полимеризации геля тщательно вымытые трубочки фиксируют на специальной подставке из оргстекла. Герметичность сборки проверяется заранее, до заполнения их гелем.

Смесь для получения 7% -ново геля в щелочной буферной системе: реактив 8—12,5 мл; реактив 9—25,0 мл; реактив 1 — 0,05 мл; реактив 2—10,0 мл; доливают водой до 100 мл.

Смесь для получения 15%-ного геля в кислой буферной системе: реактив 8х—12,5 мл; реактив 9'—25,0 мл; реактив 1—1 мл; доводят водой до 50 мл и добавляют 50 мл 0,28%-ного раствора персульфата аммония.

Смесь для полимеризации следует готовить в количестве, необходимом для опыта. Если используют, например, 12 трубочек, нужно приготовить 30 мл смеси. Осторожным вращением колбочки раствор перемешивают и вносят пипеткой в трубочки, укрепленные в подставке, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не попали внутрь полимеризуемого геля. Уровень вносимой жидкости должен находиться на расстоянии 1—1,5 см от верхнего края трубочки. Сверху осторожно наслаивают воду (0,2—0,3 мл) для образования ровной поверхности геля. Полимеризация обычно заканчивается через 20—40 мин, что определяют по образованию хорошо видимой границы между гелем и водой. По окончании полимеризации наслоенную воду удаляют фильтровальной бумагой. Трубочки снимают с подставки и ввинчивают в отверстия дна верхнего буферного резервуара (рис. 10, /). Верхний резервуар присоединяют к нижнему, предварительно заполненному электродным буферным раствором. Следят за тем, чтобы на концах трубочек не было пузырьков воздуха. На поверхность геля микропипеткой наносят растворы белков. Количество наносимого белка зависит от его гомогенности: для индивидуального белка — 25—50 мкг, для гетерогенных смесей это количество может быть увеличено до 50—250 мкг. Плотность наносимых образцов белка повышают добавлением 40%-ного раствора сахарозы до конечной концентрации 0,5 М (20%). Это необходимо для предотвращения смешивания белка с электродным буфером. Высокая ионная сила исследуемых образцов

страница 48
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
техническое обслуживание чилера
приколы купить
авито омск тисы слесарные б у
фрезирование латунных табличек

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(28.04.2017)